Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему: Тест-системы на основе полимерных микросфер для лабораторной диагностики инфекционного бронхита кур
Оглавление диссертации Ондзе Урбен Боско :: 2002 :: Москва
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Таксономия вируса ИБК.
1.2. Характеристика вируса ИБК.
1.2.1. Морфология и химический состав.
1.2.2. Устойчивость к физико-химическим воздействиям.
1.2.3. Антигенная структура.
1.2.4. Антигенная вариабельность.
1.3. Особенности иммунитета при ИБК.
1.4. Лабораторные методы диагностики ИБК.
1.4.1. Реакция гемагглютинации с трипсинизированным вирусом.
1.4.2. Реакция непрямой гемагглютинации,.
1.4.3. Реакция связывания комплемента.
1.4.4. Реакция диффузной преципитации.
1.4.5. Реакция иммунофлуоресценции.
1.4.6. Иммуноферментный анализ.
1.4.7. Полимеразная цепная реакция.
1.5. Использование полимерных микросфер в диагностике инфекционных заболеваний.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы исследования
2.1.3. Полимерные суспензии.
2.1.4. Буферные растворы и реагенты.
2.2. Методы исследования
2.2.1. Метод очистки и концентрирования вируса ИБК.
2.2.2. Метод выделения иммуноглобулина с использованием ПЭГ-4000.
2.2.3. Определение белка.
2.2.4. Иммунохимическая характеристика препаратов.
2.2.5. Оценка качества полимерных суспензий.
2.2.6. Получение антительных латексных диагностикумов и контрольного латекса.
2.2.7.Метод сенсибилизации ПМ иммуноглобулиновой фракцией сыворотки крови кур.
2.2.8. Определение концентрации Ig, адсорбированного на поверхности полимерных микросфер.
2.2.9. Метод сенсибилизации ПМ, модифицированных протеином А, антителами сыворотки крови кур.
2.2.10. Постановка и учет результатов PAJI.
2.2.11. Постановка и учет результатов ИФА.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Оценка качества полимерных суспензий при создании иммуно-диагностических тест-систем.
3.2. Разработка технологии получения латексной тест-системы на основе антигенов вируса ИБК.
3.3. Испытание экспериментальных серий латексных диагностикумов на основе антигенов вируса ИБК.
3.4. Разработка технологии получения латексной тест-системы на основе антител против вируса ИБК.
Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Ондзе Урбен Боско, автореферат
Вирусные болезни птиц, в том числе и инфекционный бронхит кур (ИБК), причиняют значительный ущерб птицеводству во всем мире. Особенно тяжело они протекают в крупных птицеводческих хозяйствах, где на ограниченном пространстве находится большое количество птиц. Поэтому обеспечение устойчивого благополучия по инфекционным болезням является первостепенной задачей ветеринарной службы [8].
ИБК - острое высококонтагиозное заболевание кур различного возраста, возбудителем которого является вирус, принадлежащий к роду Coronavirus, семейства Coronaviridae [6, 17,18, 23, 29].
В настоящее время ИБК распространен практически повсеместно [6, 17, 45, 142], что связано с постоянным появлением новых антигенных вариантов вируса, в том числе штаммов, способных вызывать заболевание у вакцинированной птицы. В зависимости от штамма возбудитель может поражать респираторные органы, почки, а также герминативные органы и кишечник кур.
Проявление ИБК часто маскируется другими болезнями вирусной и бактериальной природы. Даже при типичном течении болезни постановка диагноза по клиническим и патологоанатомическим признакам является затруднительной. Кроме того, в крупных птицеводческих хозяйствах ИБК может иметь стационарный характер и протекать как хроническая инфекция без ярко выраженных симптомов поражения респираторных органов. Поэтому представляется важным разработка методов, позволяющих выявлять вирус в патологическом материале и таким путем верифицировать диагноз.
Для профилактики ИБК используют живые и инактивированные вакцины. Их производство представляет собой современный биотехнологический процесс, по ходу выполнения которого постоянно требуется количест7 венно определять концентрацию вируса в аллантоисной жидкости для технологических целей.
Для обнаружения антигена вируса ИБК разработан "сэндвич"- вариант иммуноферментного анализа (ИФА), однако он предусматривает использование моноклональных антител, получение которых представляет определенные трудности. До сих пор не разработана тест-система, пригодная для быстрого обнаружения антигена вируса ИБК в полевых условиях и для его количественной оценки в вируссодержащих материалах, при проведении исследований в диагностических ветеринарных лабораториях.
Большое значение имеет и контроль иммунного статуса поголовья кур птицефабрик, в первую очередь, контроль поствакцинального иммунитета и его напряженности. Традиционные методы для определения уровня антител в сыворотках крови кур: реакция диффузионной преципитации (РДП), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция нейтрализации (РН), реакция иммунофлуоресценции (РИФ) и ИФА не всегда удобны для массовых исследований в силу трудоемкости для одних и невозможности стандартизации условий постановки реакции для других [12, 23].
Целью настоящих исследований явилось создание тест-систем для диагностики инфекционного бронхита кур на основе полимерных микросфер (ПМ) - латексов в качестве носителей как антигена вируса ИБК, так и противовирусных антител.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1) разработать латексную тест-систему (антительный латексный диагно-стикум) для выявления и определения уровня антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур в реакции агглютинации латекса (PAJI);
2) разработать латексную тест-систему (антигенный латексный диагно-стикум) для обнаружения антигена вируса ИБК и его количественной оценки в вируссодержащих материалах; 8
3) оценить чувствительность и специфичность разработанных тест-систем в РАЛ;
4) показать возможность практического применения разработанных латексных тест-систем в ветеринарной практике.
Впервые разработана латексная тест-система для выявления и определения антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур. Отработаны условия иммобилизации антигена вируса ИБК на ПМ без функциональных групп, а также имеющих реакционноспособные альдегидные группы на своей поверхности.
Впервые разработана латексная тест-система для выявления антигена вируса ИБК и его количественной оценки в пробах вируссодержащей аллан-тоисной жидкости (ВСАЖ) куриных эмбрионов. Впервые определены условия иммобилизации специфических антител сыворотки крови кур к вирусу ИБК на ПМ, модифицированных протеином А.
Разработанные препараты прошли апробацию во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ). По заключению экспертов антительный латексный диагностикум является специфичным, достаточно чувствительным и может быть рекомендован для контроля напряженности поствакцинального иммунитета, ретроспективной диагностики ИБК и серологического мониторинга данного заболевания. Антигенный латексный диагностикум также является специфичным и может быть использован для диагностических и технологических целей при тестировании биологического материала, содержащего не менее 5,0 lg ЭИД50 вируса ИБК.
Результаты научных исследований легли в основу проектов ряда нормативных документов:
1) Комплект научно-технической документации (НТД) на латексную тест9 систему для выявления антител к вирусу ИБК в РАЛ;
2) Комплект НТД на латексную тест-систему для выявления антигена вируса ИБК в РАЛ.
В каждый комплект входят: технические условия, инструкция по изготовлению и контролю латексного диагностикума и наставление по его применению.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Изготовление чувствительного и специфичного антительного латексного препарата для диагностики ИБК возможно только при работе с очищенным и концентрированным вирусом ИБК.
2. Синтетическими носителями вируса ИБК могут быть как полистирольные микросферы, не содержащие на своей поверхности функциональные группы, так и полиакролеиновые микросферы, содержащие на поверхности ре-акционноспособные альдегидные группы.
3. Иммобилизация антигена вируса ИБК на ПМ происходит за счет физической адсорбции.
4. На чувствительность антительных латексных препаратов для диагностики ИБК влияет жирорастворимый краситель и наличие альдегидных групп на поверхности ПМ.
5. Носителями антител против вируса ИБК могут быть полистирольные микросферы, содержащие на своей поверхности как функциональные карбоксильные группы, так и реакционноспособные альдегидные группы, модифицированные протеином А.
6. Разработанные латексные тест-системы могут быть использованы для диагностики ИБК и технологических целей.
Заключение диссертационного исследования на тему "Тест-системы на основе полимерных микросфер для лабораторной диагностики инфекционного бронхита кур"
1. Получен специфичный и достаточно чувствительный латексный диагностикум на основе антигена вируса ИБК, использование которого целесообразно для контроля напряженности поствакцинального иммунитета, ретроспективной диагностики ИБК и серологического мониторинга данного заболевания.
2. Для изготовления латексного диагностикума на основе антигена вируса ИБК наиболее пригодны ПМ с диаметром 1,5-2,0 мкм, обладающие высокой седиментационной способностью. Срок сохранения агрегативной устойчивости ПС зависит от природы полимера и характера функциональных групп на поверхности микросфер.
3. Применение неокрашенных полистирольных суспензий с диаметром частиц 2,0 мкм, не содержащих на своей поверхности функциональные группы, позволяет повысить чувствительность и специфичность диагностикумов на основе антигена вируса ИБК.
4. Иммобилизация антигена вируса ИБК на микросферах полимерных суспензий происходит за счет физической адсорбции!
5. Чувствительность диагностикумов, полученных на основе антигена вируса ИБК, зависит от жирорастворимого красителя, вводимого в полимерную суспензию и наличия альдегидных групп на поверхности микросфер.
6. Получение достаточно чувствительного и специфичного антительного латексного препарата для диагностики ИБК возможно только при работе с очищенным и концентрированным вирусом ИБК.
7. Получен специфичный латексный препарат на основе антител против вируса ИБК, использование которого целесообразно для диагностических и технологических целей при тестировании биологического материала, содержащего не менее 5,0 lg ЭИД5о вируса ИБК.
8. Синтетическими носителями антител против вируса ИБК могут быть по-листирольные микросферы, содержащие на своей поверхности как функциональные карбоксильные группы, так и реакционноспособные альдегидные группы, модифицированные протеином А.
9. Использование ПС с альдегидными группами, модифицированными протеином А, позволяет иммобилизовать на латексных частицах иммунную сыворотку против вируса ИБК без предварительного выделения из нее иммуноглобулиновой фракции.
Результаты проведенных исследований использованы при разработке следующих проектов нормативно-технических документов (Приложение 3) :
1. Технические условия на латексную тест-систему для выявления антител к вирусу ИБК в РАЛ;
2. Наставление по применению латексной тест-системы для выявления антител к вирусу ИБК в РАЛ;
3. Инструкция по изготовлению и контролю латексной тест-системы для выявления антител к вирусу ИБК в РАЛ;
4. Технические условия на латексную тест-систему' для выявления антигена вируса ИБК в РАЛ;
5. Наставление по применению латексной тест-системы для выявления антигена вируса ИБК в РАЛ;
6. Инструкция по изготовлению и контролю латексной тест-системы для выявления антигена вируса ИБК в РАЛ.
Выявление ИБК представляет значительные трудности, особенно в начале эпизоотии. Многообразие симптомов, схожесть клинических форм проявления вирусных болезней животных, вызванных возбудителями, относящимися к различным таксономическим группам, зачастую латентный характер их течения затрудняет постановку диагноза и эффективное проведение противоэпидемических и профилактических мероприятий [12]. Поэтому, чтобы с определенностью установить этиологию каждого индивидуального заболевания, необходимы лабораторные исследования, даже если клинические данные достаточно очевидны [23].
Обеспечение устойчивого благополучия хозяйств по инфекционным болезням проводится по нескольким направлениям, включающим ветеринар-но-санитарные мероприятия, профилактические и лечебные, в случае возникновения болезни. Однако ветеринарно-санитарные меры и специфическая профилактика болезней, вызываемых вирусами, при неточной диагностике не приносят желаемого результата [8].
В последние десятилетия в диагностическую практику широко внедряют иммунологические методы исследования, обладающие высокой чувствительностью и строгой специфичностью. К наиболее перспективным относят ИФА, РИФ и РИГА. Положительные результаты этих реакций с применением иммунологических препаратов характеризуют их как эффективные средства ранней диагностики, эпиданализа и эпиднадзора за различными инфекциями, однако все массовые обследования птиц, контроль напряженности иммунитета, ретроспективная диагностика, серологический мониторинг, требуют дешевого, простого и доступного метода.
В настоящее время достаточно широко обсуждается вопрос о замене эритроцитов различных видов животных, используемых в качестве носителей при создании диагностических систем, синтетическими ПМ - латексами. Это вызвано тем, что свойства биологических носителей меняются в зависимости от генетической особенности и возраста донора, от сезона, условий содержания животного и т.д. Кроме того, на поверхности эритроцитов присутствуют изоантигены, способные вызывать ложно-положительные реакции. Все это обуславливает необходимость введения различных контролей при постановке реакции на интактность носителя к используемым иммунным сывороткам и антигенам. Недостатками эритроцитарных диагностикумов являются также лабильность эритроцитов к воздействию экстремальных факторов и трудности стабилизации и стандартизации эритроцитарных препаратов. В связи с этим, в последние годы в России и за рубежом наряду с широко известными методами все большее применение находит реакция агглютинации латекса с использованием диагностических препаратов на основе ПМ. Метод латекс-агглютинации является одним из наиболее простых в техническом отношении, т.к. не требует наличия специального оборудования, высокой квалификации персонала и может проводится в полевых условиях.
Использование разработанных в настоящее время технологий позволяет получать синтетические носители разных размеров, с различными функциональными группами на поверхности частиц, способных фиксировать антигены и антитела и тем самым способствует получению стандартных и стабильных диагностических препаратов.
Учитывая изложенное, настоящая работа была посвящена разработке иммунохимических тест-систем для диагностики ИБК на основе нового поколения латексов, представляющих собой суспензии ПМ определенного гранулометрического состава, несущих на поверхности различные функциональные группы.
В результате проведенных исследований разработана технология полу
71 чения специфичных и достаточно чувствительных латексных диагностикумов как на основе антигена вируса ИБК, так и на основе антител против данного вируса.
При оценке качества ПС установлено, что наибольшей скоростью седиментации обладают ПМ с диаметром 1,5-2,0 мкм. Срок сохранения агрега-тивной устойчивости ПС зависит от природы полимера (полистирол или полиакролеин), а также от характера функциональных групп на поверхности микросфер.
Показано, что для получения достаточно чувствительного и специфичного антительного варианта латексного препарата необходимо использовать только очищенный и концентрированный вирус ИБК. Иммобилизовать на ПМ нативную вируссодержащую аллантоисную жидкость, используемую при производстве эритроцитарных диагностикумов, не представляется возможным.
Повышение чувствительности и специфичности диагностикумов на основе антигена вируса ИБК достигается путем использования неокрашенных полистирольных суспензий с диаметром частиц 2,0 мкм, не содержащих на своей поверхности функциональные группы. Иммобилизация антигена вируса ИБК на ПМ происходит за счет физической адсорбции.
Введение в микросферы ПС жирорастворимых красителей, а также наличие альдегидных групп на поверхности частиц на порядок снижают чувствительность препаратов в PAJI.
Синтетическими носителями антител против вируса ИБК могут быть ПМ, содержащие на своей поверхности как функциональные карбоксильные группы, так и реакционноспособные альдегидные группы, модифицированные протеином А.
Использование ПС с альдегидными группами, модифицированными протеином А, позволяет иммобилизовать на ПМ иммунную сыворотку против вируса ИБК без предварительного выделения иммуноглобулиновой
Таким образом, разработана технология изготовления латексных тест-систем для диагностики ИБК. Полученные препараты по заключению экспертов ВГНКИ могут применяться в ветеринарной практике для контроля напряженности поствакцинального иммунитета, ретроспективной диагностики ИБК и серологического мониторинга данного заболевания, а также для технологических целей при тестировании биологического материала, содержащего не менее 5,0 lg ЭИД50 вируса ИБК.