научная статья по теме Кинетика лизиса фибрина плазмином: ингибирование продуктами деградации фибрина Химия

Текст научной статьи на тему «Кинетика лизиса фибрина плазмином: ингибирование продуктами деградации фибрина»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1996, том 22, № 12, с. 911-915

КИНЕТИКА ЛИЗИСА ФИБРИНА ПЛАЗМИНОМ: ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОДУКТАМИ ДЕГРАДАЦИИ ФИБРИНА

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет,

119899, Москва, Воробьевы горы Поступила в редакцию 28.03.96 г.

Исследована кинетика лизиса 1251-меченых фибриновых сгустков плазмином. Обнаружено сильное конкурентное ингибирование фибринолиза продуктами деградации фибрина. Интегральным анализом полных кинетических кривых накопления продуктов деградации фибрина определены константа Михаэлиса и каталитическая константа реакции фибринолиза плазмином, а также константа ингибирования продуктами реакции: Кт 1.3 мкМ, кш 1.36 мин"1, К< 0.12 мкМ. Из полученных результатов следует, что эффективность ингибирования плазмина продуктами реакции превышает эффективность его взаимодействия с субстратом. Процесс фибринолиза плазмином регулируется по механизму отрицательной обратной связи.

Ключевые слова: плазмин, кинетика фибринолиза, продукты деградации фибрина, ингибирование.

Растворение фибрина под действием плазмина (КФ 3.4.21.7) - ключевая реакция тромболизиса, инициированного активаторами плазминогена [1]. На скорость и глубину фибринолиза влияют свойства как активаторов плазминогена, так и некоторых компонентов плазмы. Образование плазмина происходит в результате расщепления пептидной связи А1£560—Уа1561 в одноцепочечной молекуле плазминогена под действием активаторов плазминогена. Активный центр плазмина находится в С-концевой легкой В-цепи, в то время как пять кринглов, расположенных в ГЧ-концевой тяжелой А-цепи молекулы и содержащих лизин-связывающие участки, обеспечивают взаимодействие фермента (и профермента) с фибрином, фибриногеном и о^-антиплазмином. Плазминоген, плазмин и активатор плазминогена тканевого типа связываются со специфическими центрами на поверхности фибрина [2-4]. Фибрин ускоряет активацию плазминогена тканевым активатором [5, 6], а плазмин, связанный с фибрином, защищен от ингибирующего действия ос2-антиплазми-на, находящегося в плазме [7].

Исследования последних лет показали, что скорость фибринолиза значительно увеличивается в результате проникновения плазмина или активатора плазминогена внутрь сгустка с потоком жидкости [8, 9]. К настоящему времени охарактеризованы продукты деградации, образующиеся в процессе лизиса фибрина плазмином [10, 11]. Ки-

Сокращение: ПДФ - продукты деградации фибрина. # Автор для переписки (факс: (095) 939-09-97, е-таЛ:агЬ@еп-zyme.chem.msu.su).

нетических данных, касающихся непосредственного действия плазмина на трехмерную структуру фибрина, очень мало. В большинстве работ исследована общая скорость солюбилизации фибрина без определения констант скоростей реакции [12-14], что обусловлено большим числом связей, расщепляемых плазмином в фибрине, и множественностью образующихся продуктов деградации [13]. Кинетика фибринолиза осложняется и тем, что в процессе деградации появляются новые центры связывания плазмина на С-конце-вых остатках лизина расщепленных цепей фибрина [15, 16]. Таким образом, активный центр плазмина, расщепляя специфические связи на фибрине, улучшает связывание тяжелой цепи фермента с субстратом.

В настоящей работе представлены результаты исследования кинетики действия плазмина на твердофазный субстрат фибрин и влияния растворимых продуктов деградации (ПДФ) на скорость фибринолиза.

Кинетика лизиса поперечно-сшитого фибрина плазмином, не содержащим примеси активатора плазминогена, была исследована по скорости накопления растворимых радиоактивных ПДФ. Из рис. 1 видно, что в присутствии 30 нМ (а) и 60 нМ плазмина (б) реакция лизиса различных концентраций фибрина постепенно замедляется и полностью прекращается, хотя степень лизиса сгустков не превышает 60-80%. Аналогичные результаты наблюдаются во всем изученном диапазоне концентраций плазмина (5-60 нМ). Этот эффект может быть вызван либо термоинактивацией плазмина в жидкой фазе в ходе фибринолиза при 37°С,

120 160 0 40 Время, мин

Рис. I. Кинетика лизиса 125[-меченых фибриновых сгустков 30 нМ (а) и 60 нМ (б) плазмином при рН 7.4 (37°С). Начальные концентрации фибрина (мкМ): 0.44(7), 1.1 (2) и 1.54(3).

0 30 60 90 120 150 мин

Рис. 2. Изменения фибрииолитической (/, 3) и ами-дазной (2,4) активностей 30 нМ плазмина в ходе лизиса 1.54 мкМ фибрина. Активности фермента измеряли в неразбавленных (светлые символы) и разбавленных в 20 раз пробах (темные символы). Условия определения см. в "Экспер. части".

либо ингибированием фибринолиза накапливающимися продуктами реакции.

Возможность термоинактивации плазмина в ходе фибринолиза была проверена определением амидазной и фибрииолитической активностей в пробах, отобранных из жидкой фазы и разбавленных в 20 раз для элиминирования влияния ПДФ, При этом фибринолитическую активность проб контролировали по степени лизиса свежих стандартных 12*1-меченых фибриновых сгустков, а амидазную - по скорости гидролиза пептидного субстрата 8-2251. Было найдено, что обе активности плазмина, измеренные после разбавления проб, стабильны в течение 2.5-3 ч при 37°С (рис. 2, 3 и 4). Следовательно, эффект торможения фибринолиза (рис. 1) не обусловлен термоинактивацией плазмина. С другой стороны, когда активности в тех же пробах были измерены без предварительного разбавления, в ходе фибринолиза наблюдалось резкое падение фибрииолитической активности (рис. 2, /) и постепенное уменьшение амидазной активности плазмина (рис. 2, 2). Таким образом, причиной замедления и прекращения

деградации фибрина (рис. 1) является ингибирова-ние фибринолиза накапливающимися ПДФ, которые в отличие от фибрина содержат большее число С-концевых остатков лизина для связывания плазмина. Поэтому тип ингибирования реакции продуктами, обладающими большим сродством к ферменту по сравнению с исходным субстратом, должен быть конкурентным.

Для определения кинетических параметров реакции полные кинетические кривые фибринолиза плазмином, представленные на рис. 1, анализировали по интегральному уравнению Уокера-Шмидта[17]:

где [Р] - концентрация продуктов в момент времени /; [F]0 - начальная концентрация фибрина; V = &cat[Pm]0 - максимальная скорость лизиса фибрина плазмином (Pin); Á'm - константа Михаэли-са для процесса деградации фибрина плазмином; К< - константа ингибирования фибринолиза продуктами реакции.

Линейные зависимости [P]/í от l//in, полученные из данных рис. 1 (а, б), представлены на рис. 3 (а, б). Положительный наклон этих зависимостей и отрицательное значение отрезков, отсекаемых ими на оси ординат, свидетельствуют о наличии значительного конкурентного ингибирования фибринолиза продуктами реакции [17, 18]. Величина отрезка, отсекаемого на оси абсцисс (Ь), уменьшается с увеличением начальной концентрации фибрина. Согласно уравнению (1), зависимость обратной величины этого отрезка (1 Ib) от начальной концентрации фибрина [F]0 описывается уравнением

Линейные зависимости величины 11Ь от [Р]0 при двух концентрациях плазмина (рис. Зв) отсекают на оси абсцисс отрезок, который, согласно уравнению (2), равен -К,. Найденное значение А' (0.12 мкМ) подтверждает, что ПДФ оказывают достаточно сильное ингибирующее действие на реакцию фибринолиза плазмином. Наблюдаемое ингибирование может быть объяснено тем, что фибрин и ПДФ конкурируют друг с другом за одни и те же лизинсвязывающие центры плазмина. В процессе лизиса плазмин специфически расщепляет пептидные связи фибрина, образованные карбоксильными группами лизина и аргинина. Вероятно, растворимые ПДФ, имеющие по сравнению с фибрином большее число экспонированных лизитювых центров, сильнее связывают плаз-мин, снижая его сорбцию-на фибрине и ингибируя тем самым фибринолиз. Следует отметить, что

0.01 0.02 0.03 -0.5 0 0.5 1.0 1.5 2.0 1, [Р]0 -1 [Р]0, мкМ

Рис. 3. Представление данных рис. 1 в координатах Уокера-Шмидт;! (а, б) и графическое определение К\ лизиса фибрина в присутствии 30 нМ (светлые символы) и 60 нМ плазмина (темные символы) (в).

Рис. 4. Кинетика лизиса 1-меченого фибринового сгустка (0.44 мкМ) в присутствии 5 (/), 10 (2), 30 (3) и 60 нМ (4) плаз-мина (а) и линейная анаморфоза кинетических кривых, представленных на рис. 4а, в координатах Уокера-Шмидта (б).

растворимый фибриноген вызывает меньший ин-гибирующий эффект при фибринолизе плазми-ном (К, 12 мкМ [12]), чем ПДФ. Недоступность плазмину части лизиновых центров и меньшее по сравнению с ПДФ число С-концевых лизиновых центров в интактной молекуле фибриногена [19] могут быть причиной более слабого связывания растворимого фибриногена с плазмином и инги-бирования им фибринолиза. Это подтверждается значительным различием констант диссоциации для взаимодействия Ьуз-плазминогена с фибриногеном (А^ 1 мМ) и с его фрагментом Е (Кй 8.3 мкМ) [3].

Константа Михаэлиса (Кт) реакции лизиса фибрина плазмином, вычисленная, согласно уравнению (1), из тангенсов углов наклонов линейных зависимостей Уокера-Шмидта при различных концентрациях фибрина (рис. За, б), оказалась равной 1.3 мкМ. Несколько меньшая величина константы Михаэлиса (0.42 мкМ) была ранее найдена для реакции лизиса плазмином суспензии микрогранул фибрина диаметром 3 мкм [12], что, вероятно, связано с повышенной концентрацией

доступных для плазмина сорбционных и расщепляемых центров на значительно большей площади поверхности микрочастиц фибрина. Найденная величина Кт для реакции лизиса фибринового сгустка плазмином на два порядка ниже, чем Кт 200-300 мкМ для реакции гидролиза ферментом низкомолекулярных специфических пептидных субстратов [20]. Более низкое значение Кт реакции фибринолиза обусловлено существенным вкладом в связывание фермента с фибрином взаимодействия лизинсвязывающих участков тяжелой цепи плазми

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎