Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему: Выделение и исследование сапонинов сахарной свеклы
Оглавление диссертации Брежнева, Татьяна Александровна :: 2003 :: Москва
Часть I. Обзор литературы.
1.1. Сапонины, их классификация, химическое строение и свойства.
1.2. Выделение сапонинов из растительного сырья.
1.3. Выделение сапонинов из промотходов.
1.4. Методы определения сапонинов в растительном сырье и фармпрепаратах.
1.5. Фармакологическая активность сапонинов.
1.6. Растение Beta vulgaris L. var. altissima Rössig, его ботанические особенности, химический состав и история использования в качестве пищевого продукта и лекарственного растения.
1.7. Сапонины сахарной свеклы, их химическое строение, свойства, получение и определение.
Часть II. Материалы и методы исследования.
2.1. Характеристика растительного сырья.
2.2. Отходы сахарного производства, используемые в качестве источника сапонинов, и их характеристика.
2.3. Неионогенный макропористый сорбент «Стиросорб 1 - МХДЭ х 100».
2.4. Методика качественного определения сапонинов методом ТСХ.
2.5. Методика количественного определения сапонинов в растительном сырье и отходах сахарного производства.
2.6. Получение очищенного образца олеаноловой кислоты.
2.7. Методика подготовки образцов сапонинов для проведения ИК-спектроскопического исследования.
Часть III Исследование растения Beta vulgaris L. var. altissima Rössig как потенциального источника сапонинов. Выделение сапонинов из корнеплодов сахарной свеклы и отходов сахарного производства, исследование качественного и количественного состава полученных суммарных сапонинных фракций.
3.1. Определение содержания сапонинов в отдельных частях растения Beta vulgaris L. var. altissima Rossig.
3.2. Получение первичных сапонинсодержащих извлечений из корнеплодов сахарной свеклы.
3.2.1. Планирование эксперимента. Анализ факторов, способных оказать влияние на качество получаемых первичных извлечений.
3.2.2. Определение действующих и сопутствующих веществ в извлечениях из корнеплодов.
3.2.2.1. Разработка методики количественного определения сапонинов методом ВЭТСХ с применением сканирующей денситометрии.
3.2.2.2. Определение красящих веществ в извлечениях методом УФ-спектрофотометрии.
3.2.2.3. Определение липофильных фракций в извлечениях методом УФ-спектрофотометрии.
3.2.3. Оценка влияния исходных характеристик растительного сырья на состав и качество первичных извлечений.
3.3. Очистка промежуточных сапонинсодержащих фракций экстракционными методами.
3.4. Получение целевых очищенных суммарных сапонинных фракций в виде аммонийных солей.
3.5. Очистка сапонинов на неионогенном макропористом сорбенте «Стиросорб».
3.6. Получение сапонинов из отходов сахарного производства.
3.7. Сравнение качественного и количественного состава суммарных сапонинных фракций, полученных с использованием разных схем выделения, выбор оптимальных условий проведения процесса.
Часть IV Разработка методик контроля качества и проведение стандартизации суммы аммонийных солей сапонинов сахарной свеклы.
4.1. Определение подлинности и степени чистоты сапбета (суммы аммонийных солей сапонинов сахарной свеклы).
4.1.1. Оценка внешнего вида и определение растворимости в различных растворителях.
4.1.2. Проведение испытаний на подлинность.
4.1.3. Проведение испытаний на чистоту (определение содержания примесей).
4.1.4. Определение остаточных органических растворителей в сапбете методом ГЖХ.
4.2. Исследование спектральных характеристик водных и спиртовых растворов сапонинов и их количественное определение методом прямой УФ-спектрофотометрии.
4.3. Анализ сапонинов, основанный на количественном определении агликона после гидролиза.
4.3.1. Проведение кислотного гидролиза сапонинов, исследование гидролизата методом ТСХ.
4.3.2. Разработка методики количественного определения сапонинов, основанной на потенциометрическом неводном титровании агликона.
4.3.3. Разработка методики количественного определения сапонинов, основанной на УФ-спектрофотометрическом определении агликона после гидролиза.
4.4. Определение сапонинов методом ВЭЖХ.
4.5. Сравнительная характеристика методик определения сапонинов в растительном сырье, промотходах, промежуточных извлечениях и целевых сапонинных фракциях.
4.6. Исследование суммарных сапонинных фракций методом ИК-спектроскопии.
Часть V. Первичная оценка фармакологической активности суммы аммонийных солей сапонинов.
5.1. Определение острой токсичности сапонинов.
5.2. Исследование адаптогенного действия сапонинов
5.2.1. Оценка адаптогенного действия сапонинов в опытах на простейших.
5.2.2. Исследование физической работоспособности.
5.3. Исследование нейролептического действия сапонинов сахарной свеклы.
5.4. Первичная оценка гипогликемического действия сапонинов.
Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Брежнева, Татьяна Александровна, автореферат
Актуальность проблемы. В медицине достаточно широко используются препараты на основе тритерпеновых сапонинов. Многие из них обладают адаптогенным и гипогликемическим действием. Неспецифичность действия подобных лекарственных средств позволяет использовать их для комплексного лечения и профилактики различных заболеваний. Растительное же происхождение обеспечивает им низкую токсичность, большую широту терапевтического действия и минимум побочных эффектов.
Среди адаптогенов растительного происхождения значительное место занимают тритерпеновые сапонины - производные олеаноловой кислоты. Сапонины подобной структуры входят в состав корнеплодов сахарной свеклы. Распространенность и доступность растительного сырья, а также прогнозируемая по аналогии со сходными соединениями адаптогенная активность сапонинов, делает проблему их выделения и изучения актуальной.
Использование для выделения сапонинов отходов сахарного производства позволяет упростить процесс получения и одновременно решить серьезную экологическую проблему - сократить поступление сапонинов в окружающую среду.
Ввиду отсутствия приемлемых методов контроля содержания сапонинов в сырье, промотходах и целевых очищенных фракциях актуальной является также разработка доступных методик их количественного определения.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение растения Beta vulgaris L. var. altissima Rossig как потенциального источника сапонинов, выделение сапонинов из растительного сырья и отходов сахарного производства, их последующая стандартизация и оценка фармакологической активности.
В связи с поставленной целью задачами исследования являлись:
- изучение локализации сапонинов в растении Beta vulgaris L. var. altissima Rossig;
- исследование особенностей использования корнеплодов сахарной свеклы в качестве сырья для получения сапонинов;
- разработка методик количественного определения сапонинов в растительном сырье, промотходах, промежуточных и целевых очищенных суммарных сапонинных фракциях;
- разработка оптимальных схем выделения сапонинов из корней сахарной свеклы и промотходов, изучение факторов, оказывающих влияние на качественный и количественный состав выделяемых сапонинных фракций;
- исследование выделенных сапонинов с использованием физических и физико-химических методов анализа;
- проведение стандартизации "Суммы аммонийных солей сапонинов сахарной свеклы" ("Сапбета");
- экспериментальная оценка фармакологической активности суммы аммонийных солей сапонинов сахарной свеклы.
Научная новизна. Проведена оценка локализации сапонинов в растении Beta vulgaris L. var. altissima Rossig. Выявлена неидентичность состава сапонинов корнеплодов и листьев изучаемого растения.
Установлено, что сапонины корнеплодов и листьев сахарной свеклы имеют один общий агликон - олеаноловую кислоту и отличаются составом сахарных остатков, в число которых входят D-глюкуроновая кислота, D-глюкоза и D-ксилоза.
Разработаны методики количественного определения сапонинов в растительном сырье, промотходах, промежуточных и целевых суммарных фракциях, в основе которых лежат современные физико-химические методы анализа, такие как ВЭЖХ, ВЭТСХ, УФ-спектрофотометрия.
Разработана и апробирована методика, позволяющая определять соотношение индивидуальных сапонинов, входящих в состав суммарных фракций.
С использованием разработанных методик проведен постадийный контроль процесса выделения сапонинов, рассчитаны их потери на каждой из стадий извлечения и очистки, рекомендованы оптимальные условия проведения процесса.
На основании выполненных исследований разработаны схемы получения сапонинов из свежего и высушенного растительного сырья.
Впервые проведено обоснование возможности использования для получения сапонинов отходов сахарного производства, разработаны соответствующие схемы выделения.
Установлено, что выделенные сапонины проявляют адаптогенную и гипогликемическую активность.
Приоритетность научных исследований подтверждена патентом на изобретение № 2179978 РФ по заявке № 2000129545/04 (031321) от 24.11.2000.
Практическая значимость работы.
Найдены новые перспективные источники получения ценных биологически-активных веществ, обладающих адаптогенным и гипогликемическим действием.
Разработаны схемы получения сапонинов из корнеплодов сахарной свеклы и отходов сахарной промышленности, которые могут быть применены в промышленном производстве лечебно-профилактических препаратов.
Показана возможность использования выделенных сапонинов для получения олеаноловой кислоты, применяемой как стандартное вещество при проведении контроля качества различных видов растительного сырья и препаратов из него.
Установленное экспериментально преимущество применения в качестве сырья корнеплодов малой массы, не подлежащих переработке на сахар, позволяет более полно использовать растительное сырье, а применение измельченных высушенных корнеплодов значительно расширяет сроки его переработки. Выделение сапонинов из отходов производства позволяет одновременно решить экологическую проблему -снизить их поступление в окружающую среду.
Проведенная стандартизация полученных суммарных сапонинных фракций положена в основу разрабатываемой нормативной документации на БАД «Сумму аммонийных солей сапонинов сахарной свеклы» ("Сапбет").
Разработанные методики количественного определения могут быть внедрены на сахарных заводах для контроля содержания сапонинов в корнеплодах сахарной свеклы, полупродуктах, продуктах и отходах производства, а также могут быть использованы для их определения в почвах, природных и сточных водах.
Внедрение результатов исследования в практику.
Проведено внедрение разработанных методик количественного определения сапонинов в растительном сырье и отходах сахарной промышленности при проведении учебных и научно-исследовательских работ на кафедре органической химии и в "Лаборатории инструментальных методов пищевой химии" Воронежской
Государственной Технологической Академии (Акт о внедрении от 17.01.2003г.), а также на Фармацевтическом факультете Воронежского госуниверситета (Акт № 3 от 05.10.2001г.)
Проведена первичная оценка фармакологической активности полученных стандартизованных образцов, содержащих сумму сапонинов сахарной свеклы (в виде аммонийных солей ), на кафедре экспериментальной и клинической фармакологии Воронежского госуниверситета. В результате экспериментов на животных (мыши) установлено адаптогенное и гипогликемическое действие сапонинов ( Акт испытаний от 22.04.02г.)
Основные положения, выдвигаемые на защиту:
- результаты исследований локализации сапонинов в растении Beta vulgaris L. var. altissima Rossig и особенностей его использования в качестве сырья для получения сапонинов;
- методики количественного определения сапонинов в растительном сырье, промотходах, промежуточных и целевых суммарных сапонинных фракциях;
- разработка оптимальных схем выделения сапонинов из корнеплодов сахарной свеклы и отходов сахарной промышленности;
- результаты стандартизации образцов, выделенных из корнеплодов и промотходов, и содержащих 72 - 78% суммы аммонийных солей сапонинов сахарной свеклы;
- результаты фармакологических исследований полученных сумм аммонийных солей сапонинов сахарной свеклы.
Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с целевой программой «Сахарный диабет» Правительства Российской Федерации (№ 1171 от 07.10.1996 г.) и по Координационному плану Научного Совета по адсорбции и хроматографии РАН 2000-2001 г.г. (Тема: "Применение хроматографических процессов для очистки и получения биологически-активных соединений").
Исследования проводились в соответствии с планом научно-исследовательских работ Министерства Образования Российской Федерации (№ 01.9.9000.1110 ) "Синтез и исследование свойств эффективных противотуберкулезных средств и стимуляторов иммунитета на основе гидрофильных мономеров, полимеров, углеводов".
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на:
- Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (г.Москва, 2000 г.);
- IV Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (г.Москва, 2001 г.);
- IX Международной конференции «Иониты-2001» (г.Воронеж,2001 г).
- IX Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва, 2002 г.);
- Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (г. Москва, 2002 г.)
- Всероссийской конференции «Фагран-2002» (г.Воронеж, 2002 г.)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 7 статей, 5 тезисов, 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена ча 199 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков, 25 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, 3 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 205 наименований, в т.ч. 62 источника иностранных авторов, и "Приложений".