ТЕХНИКА ПОСЕВА, МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР И КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА БАКТЕРИЙ

Цель занятия. Освоить технику посева микроорганизмов на плотные и жидкие питательные среды и методы выделения чис­тых бактериальных культур. Ознакомить студентов с основными культуральными характеристиками микроорганизмов и методами определения количества бактерий.

Оборудование и материалы. Бульонные и агаровые культуры В. cereus, Е. coli и S. aureus в пробирках и в чашках Петри, сме­шанная бульонная культура Е. соli и S. aureus, стерильные МПА и МПБ в пробирках, чашках Петри, солевой МПА (8 % хлорида натрия) в чашках Петри, стеклянные шпатели, стерильные пи­петки Пастера, бактериологические петли.

Культура микроорганизмов — это популяция (расплодка) кле­ток на питательной среде. Посев и пересев культур микроорга­низмов на питательные среды — наиболее частый методический прием, который используют для первичного выделения микро­организма из какого-либо объекта, а также для поддержания культур в жизнеспособном состоянии в лабораторных условиях.

Чистая культура — это популяция бактерий одного вида или биологического варианта (биовара), выращенная на питательной среде.

Штаммы — чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделенные из разных объектов или из одного и того же объекта, но в разное время.

Колония — макроскопически видимое скопление клеток мик­роорганизма на поверхности или внутри плотной питательной среды, образовавшихся в результате размножения одной жизне­способной клетки. По этой причине колонию обычно рассматри­вают как чистую культуру микроорганизма.

Техника посева микроорганизмов. Посевы из нативного мате­риала чаще проводят пастеровской пипеткой, из культур микро­организмов—бактериологической петлей в зоне стерильного воздуха над пламенем горелки. На культуральных сосудах (про­бирки, чашки Петри, колбы и т.д.) пишут номер экспертизы, под которым зарегистрирован материал, дату посева.

Посев на жидкую питательную среду. Пробирку с исследуемым материалом и пробирку с питательной средой держат в левой руке, в правую руку берут бактериологическую петлю или пипет­ку и'пробки от пробирок (рис. 37). Над пламенем горелки обжи­гают края пробирок, бактериологическую петлю (пипетку) вводят в пробирку с материалом, переносят материал в пробирку со сте­рильной питательной средой и стряхивают с петли в среду, не смачивая при этом петледержатель. Края пробирок вновь прово­дят над пламенем горелки, закрывают пробирки пробками, сте­рилизуют петлю и ставят ее в штатив. Использованную пипетку опускают концом вниз в банку с дезинфицирующим раствором.

Посев на плотную питательную среду. Выполняют разными способами.

При посеве в пробирку: 1) пробирки с засеваемой мик­робной культурой и питательной средой (МПА) берут в левую руку, пробирку с МПА держат скошенной поверхностью среды вверх. В открытую у пламени пробирку с микробной культурой (или другим материалом) вводят простерилизованную бактерио­логическую петлю, слегка прикасаясь петлей к поверхности сре­ды (материала), берут материал, переносят его в пробирку со сте­рильной питательной средой. Петлю опускают до дна пробирки, погружают в конденсационную жидкость и зигзагообразным движением проводят снизу вверх по поверхности среды (посев «штрихом») (рис. 38). Пробирки закрывают пробками, петлю прожигают. Пробирки с посевами ставят в термостат; 2) при по­севе уколом в столбик среды пробирку с плотной (нескошенной) средой берут в левую руку, над пламенем горелки извлекают из пробирки пробку, петлей с материалом прокалывают вертикаль­но по центру пробирки питательную среду, петлю вынимают, прожигают, пробирку с засеянной средой закрывают пробкой (рис. 39).

При посеве на чашку Петри: чашку берут в левую руку, большим пальцем левой руки слегка приподнимают крышку, об­жигают на пламени горелки края чашки в зоне щели, вносят по­севной материал на поверхность питательной среды, затем рас­тирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологи­ческой петли (рис. 40).

Посев на полужидкую питательную среду. Выполняют методом укола в столбик питательной среды.

Выделение чистых культур микроорганизмов. При бактериоло­гическом исследовании искомый микроорганизм обнаруживают в материале, как правило, в смеси с бактериями других видов. Классическими методами бактериологии возможно идентифици­ровать микроорганизм только при условии, что он находится в виде чистой культуры.

Методы, основанные на механическом разобщении клеток. Эти методы наиболее часто применяют при выделении чистых куль­тур микроорганизмов.

Метод Пастера (метод разведений): из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных разведений на стерильной жидкой питательной среде в пробир­ках или колбах (10 -1 …10 -10 ). Предполагают, что количество мик­робных клеток в каждом последующем разведении будет меньше, чем в предыдущем, и в какой-то из пробирок останется только одна микробная клетка, которая и даст/начало чистой культуре Микроорганизма. Однако для успешного применения этого мето­да необходимо, чтобы искомый микроорганизм в материале ко­личественно преобладал над сопутствующими видами.

Метод Коха (метод заливок): исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и ох­лажденным до 45. 50 "С МПА, перемешивают, затем каплю пи­тательной среды переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т. д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Затем содержимое каждой пробирки выливают в стерильные чашки Петри, после затвердения среды посевы помещают в термостат. Фиксированные в плотной среде микробные клетки при размно­жении формируют колонии, из которых можно отвить (пересе­ять) чистую культуру микроорганизма.

Метод Дригальского: берут три—пять чашек Петри с плотной питательной средой. В одну из чашек вносят посевной материал и распределяют его шпателем по поверхности пита­тельной среды. Не обжигая шпатель, оставшийся на нем матери­ал последовательно растирают на поверхности среды во второй, третьей и остальных чашках. В последних чашках Петри после инкубирования в термостате обычно наблюдают формирование изолированных колоний бактерий.

Более экономичен следующий способ получения изолированных колоний. Бактериологичес­кой петлей с посевным матери­алом несколько раз делают па­раллельные штрихи в одном секторе чашки Петри с пита­тельным агаром (рис. 41). Пет- о лю прожигают в пламени горел­ки, дают остыть и часть матери­ала из первого сектора