Исследование клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Перечень наборов реагентов «АмплиСенс®» производства ФГУН ЦНИИЭ для выявления ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Выявляемые микроорганизмы (возбудители инфекций)

Наборы реагентов

Бактериальные инфекции

Chlamydia trachomatis

«АмплиСенс® Chlamydia trachomatis-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Neisseria gonorrhoeae

«АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-скрин-FL» «АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-тест-FL» «АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Treponema pallidum

«АмплиСенс® Treponema pallidum-FL»

Mycoplasma genitalium

«АмплиСенс® Mycoplasma genitalium -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum

«АмплиСенс® Ureaplasma spp.-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Mycoplasma hominis

«АмплиСенс® Mycoplasma hominis -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Gardnerella vaginalis

«АмплиСенс® Gardnerella vaginalis -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Вирусные инфекции – герпесвирусы

HSV I, II

«АмплиСенс® HSV I , II-FL» «АмплиСенс® HSV- typing-FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

«АмплиСенс® CMV -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Протозойные инфекции

Trichomonas vaginalis

«АмплиСенс® Trichomonas vaginalis -FL» Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Грибковые инфекции

Candida albicans

«АмплиСенс® Candida albicans -FL»

Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei

Набор серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Одновременно выявляемые микроорганизмы

Наборы реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp. / Mycoplasma genitalium

«АмплиСенс® C. trachomatis / Ureaplasma / M. genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp./ Mycoplasma hominis

«АмплиСенс® C. trachomatis / Ureaplasma / M. hominis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Neisseria gonorrhoeae / Chlamydia trachomatis / Mycoplasma genitalium / Trichomonas vaginalis

«АмплиСенс® N.gonorrhoeae / C.trachomatis / M.genitalium / T.vaginalis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp. / Mycoplasma genitalium / Mycoplasma hominis

«АмплиСенс® C.trachomatis / Ureaplasma /M.genitalium / M.hominis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Neisseria gonorrhoeae / Chlamydia trachomatis / Mycoplasma genitalium /

АмплиСенс® N.gonorrhoeae / C.trachomatis / M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

HSV I / HSV II

«АмплиСенс® HSV-typing -FL»

Ureaplasma parvum / Ureaplasma urealyticum

«АмплиСенс® U.parvum / U.urealyticum-FL» (выявление и дифференциация)

Trichomonas vaginalis / Neisseria gonorrhoeae

«АмплиСенс® T.vaginalis / N.gonorrhoeae -МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp.

АмплиСенс® C.trachomatis / Ureaplasma -МУЛЬТИПРАЙМ-FL» (FEP)

Chlamydia trachomatis / Mycoplasma genitalium

АмплиСенс® C.trachomatis / M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL» (FEP)

Candida albicans / Candida glabrata / Candida krusei /

«АмплиСенс® C.albicans / C.glabrata / C.krusei-FL»

HSV / CMV

«АмплиСенс® HSV / CMV-FL»

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В настоящих методических рекомендациях применяются следующие сокращения и обозначения:

- внутренний контрольный образец для наборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

- инфекции, передаваемые половым путем

- отрицательный контрольный образец

- положительный контрольный образец

- полимеразная цепная реакция

ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора

- Федеральное государственное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

- флуоресцентная детекция по «конечной точке»

- флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»

- серия наборов для одновременного выявления ДНК нескольких микроорганизмов в одной ПЦР

ПРИНЦИП МЕТОДА

Выявление микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией включает в себя три этапа: экстракцию (выделение) ДНК из образцов клинического материала, амплификацию фрагмента ДНК данного микроорганизма и гибридизационно-флуоресцентную детекцию, которая производится либо непосредственно в ходе ПЦР (вариант FRT), либо после ее завершения (вариант FEP). Экстракция ДНК из клинического материала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО-FL), который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами ДНК проводится реакция амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма при помощи специфичных к нему праймеров и фермента Taq-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. К олигонуклеотидным зондам, специфичным к различным ДНК-мишеням, прикреплены различные флуоресцентные метки. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации каждой ДНК-мишени путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала по соответствующему каналу. Детекция флуоресцентного сигнала при использовании варианта FEP осуществляется после окончания ПЦР с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, а при использовании варианта FRT – непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени». В обоих случаях детекция результатов ПЦР осуществляется без извлечения продуктов реакции из пробирок, что позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами ПЦР. Дополнительным преимуществом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией является возможность автоматизировать учет результатов анализа, снизить субъективизм в интерпретации результатов. Преимуществом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией являются также широкие возможности проведения мультиплексного ПЦР-анализа, т.е. одновременное проведение амплификации и детекции нескольких ДНК-мишеней (ДНК нескольких микроорганизмов) с помощью одной реакции. При этом благодаря проведенной оптимизации сохраняется высокая чувствительность в отношении каждой из выявляемых ДНК-мишеней. Использование мультиплексной ПЦР позволяет повысить производительность выполнения анализа в три-четыре раза без увеличения приборной базы лаборатории. Для мультиплексного ПЦР-анализа с гибридизационно-флуоресцентной детекцией предназначены наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ».

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I – IV групп патогенности». Исследование разделяется на три этапа и проводится в трех помещениях (ЗОНАХ): В ЗОНЕ 1 проводится первичный разбор, регистрация поступивших проб в рабочий журнал и предварительная обработка клинического материала. В ЗОНЕ 2 проводится экстракция ДНК из клинического материала. В ЗОНЕ 3 проводится подготовка пробирок для проведения ПЦР и проведение ПЦР и гибридизационно-флуоресцентной детекции.

При работе всегда следует выполнять следующие требования:

• Использовать наконечники с фильтрами для автоматических дозаторов. Для каждой процедуры использовать новый наконечник.
• Следует рассматривать образцы как потенциально вызывающие инфекцию и хранить в биологическом кабинете в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
• Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя дезинфицирующие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
• Уничтожать образцы и неиспользованные реактивы в соответствии с требованиями СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений».

ВНИМАНИЕ! При утилизации пробирок, содержащих продукты ПЦР после амплификации, недопустимо их открывание и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами амплификации лабораторной зоны, оборудования и реагентов. Интерпретация результатов и внесение готовых результатов в журнал проводит аккредитованный врач-лаборант. Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике заболевания.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

Для взятия клинического материала: Транспортная среда - «Транспортная среда с муколитиком (ТСМ)» (ТУ 9398-098-01897593-2009) или «Транспортная среда для мазков» (ТУ 9398-088-01897593-2009), или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (при работе с формами комплектации 1–3). Для предобработки клинического материала и проведения экстракции ДНК из клинических образцов (ЗОНЫ 1-2):

• Комплект реагентов для выделения ДНК - «ДНК-сорб-АМ» (ТУ 9398-036-01897593-2009) или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
• Бокс биологической безопасности (бокс абактериальной воздушной среды) 2 класса защиты (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия).
• Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).
• Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например, «MiniSpin», «Eppendorf», Германия).
• Вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
• Отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).
• Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия).
• Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, «Axygen», США).
• Штативы для микропробирок на 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, «Axygen», США).
• Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
• Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
• Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.
• Отдельный халат и одноразовые перчатки.
• Емкость с дезинфицирующим раствором.
• Одноразовые пластиковые контейнеры для сброса и инактивации материалов.

Для проведения амплификации и флуоресцентной детекции (ЗОНА 3):

• Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
• Центрифуга/вортекс.
• Автоматические дозаторы переменного объема (от 5 до 20 мкл, при работе с «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F – от 5 до 20 мкл и от 20 до 200 мкл).
• Одноразовые наконечники с фильтром до 100 мкл в штативах.
• Штативы для микропробирок объемом 0,2 мл или 0,5 мл (в соответствии с используемыми комплектами реагентов). Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С для выделенных проб ДНК.
• Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.1888-04.
• Емкость для сброса наконечников.

При работе с «ПЦР-комплектом» вариант FEP:

• Программируемый амплификатор (например, «Терцик» («ДНК-Технология», Россия), «Gradient Palm Cycler» («Corbett Research», Австралия), «MAXYGENE» («Axygen», США), «GeneAmp PCR System 2700» («Applied Biosystems») или аналогичные).
• Флуоресцентный ПЦР-детектор (например, «AЛА-1/4» («BioSan», Латвия), «Джин» («ДНК-Технология», Россия) или аналогичные).
• Пластиковая пипетка для минерального масла (для работы с «ПЦР-комплектом» вариант FEP-1000).

При работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT: 8. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» – при работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT (например, «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research», Австралия), «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия), «iQ5» («Bio-Rad», США), «Mx3000P» («Stratagene», США), «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) или аналогичные). 9. Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР объемом 0,2 мл или 0,1 мл – при работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT-100 F: а) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с выпуклой крышкой (например, «Axygen», США) – при использовании прибора планшетного типа; б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой (например, «Axygen», США), или пробирки для ПЦР к «Rotor-Gene», объемом 0,1 мл в стрипах по 4 шт. с крышками (например, «Corbett Research», Австралия; «Qiagen», Германия) – при использовании прибора роторного типа.

Для проведения анализа, как правило, используются следующие виды клинического материала:

• У женщин: соскобное отделяемое слизистых оболочек цервикального канала, влагалища, уретры; моча.
• У мужчин: соскобное отделяемое слизистой оболочки уретры, моча, секрет предстательной железы.
• У детей: моча, отделяемое конъюнктивы глаз.

Взятие клинического материала должно производиться в пробирки с транспортной средой, рекомендованной ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Полученные образцы (кроме образцов мочи) можно транспортировать и хранить в следующих режимах:

• при комнатной температуре – в течение 48 часов;
• при температуре от 2 до 8 °С – в течение двух недель;
• при температуре не выше мину 20 °С – в течение месяца;
• при температуре не выше минус 68 °С – длительно.

Полученные образцы, помещенные в транспортную среду с муколитиком (ТСМ), можно транспортировать и хранить:

• при комнатной температуре (от 18 до 25 °С) до 28 суток;
• при температуре от 2 до 8 °С до 3 месяцев;
• при температуре не выше минус 20 °С – длительно.

Допускается однократное замораживание-оттаивание клинических образцов. Полученные образцы мочи можно транспортировать и хранить:

• при комнатной температуре – в течение 6 часов;
• при температуре от 2 до 8 °С – в течение суток;

Доставка клинических образцов осуществляется в специальном контейнере с охлаждающими элементами. Для проведения исследования на наличие ДНК определенного микроорганизма анализируются следующие виды клинического материала: - для выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma spp.,U.parvum / U.urealyticum, Mycoplasma hominis–соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, образцы мочи, секрет предстательной железы человека. - для выявления ДНК Chlamydia trachomatisи Neisseria gonorrhoeae возможно также исследовать отделяемое конъюнктивы глаз, соскобное отделяемое слизистых оболочек прямой кишки, ротоглотки.

• для выявления ДНК HSVI и II типов, Treponema pallidum– соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, прямой кишки, ротовой полости, отделяемое везикул (пузырьковых высыпаний) и эрозивно-язвенных поражений кожи и слизистых оболочек.
• для выявления ДНК HSVI и II типов можно также исследовать цельную кровь и ликвор, отделяемое конъюнктивы глаз.
• для выявления ДНК CMV – соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, моча, слюна и цельная кровь.
• для выявления ДНКCandida albicans– соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, ротовой полости; моча.
• для выявления ДНКGardnerella vaginalis– соскобное отделяемое слизистой оболочки влагалища.

При использовании секрета предстательной железы, цельной крови или ликвора для экстракции ДНК рекомендуется использовать комплект реагентов «ДНК-сорб-B».

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ

ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:

• Экстракция (выделение) ДНК из исследуемых (клинических) образцов;
• Проведение амплификации (вариант FEP) или амплификации с детекцией в режиме «реального времени» (вариант FRT) *.
• Флуоресцентная детекция продуктов амплификации (вариант FEP).
• Анализ и интерпретация результатов.

*) При использовании ПЦР-комплектов вариант FRT проводят ПЦР с детекцией в режиме «реального времени», т.е. совмещают этапы амплификации и детекции продуктов амплификации. При использовании ПЦР-комплектов вариант FEP флуоресцентная детекция проводится отдельным этапом после завершения амплификации («по конечной точке»).

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ

Для экстракции (выделения) ДНК используются наборы реагентов, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, в соответствии с инструкцией к используемому набору. Экстракция ДНК из каждого клинического образца проводится в присутствии внутреннего контрольного образца – ВКО-FL. При использовании набора реагентов, включающего комплект «ДНК-сорб-АМ», для экстракции ДНК используется входящий в набор комплект «ДНК-сорб-АМ» (за исключением экстракции из образцов клинического материала, для которого рекомендуется использовать комплект «ДНК-сорб-B»).

Предварительная обработка образцов клинического материала (требуется только для образцов мочи) Взболтать флакон с мочой. Перенести 1 мл мочи в стерильную одноразовую пробирку объемом 1,5 мл, используя отдельный наконечник с фильтром для каждого образца. Центрифугировать 5 мин при 10000 g (12 тыс об/мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf). При наличии большого количества солей ресуспендировать только верхний слой осадка солей в объеме 1 мл и затем снова центрифугировать. Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удалить надосадочную жидкость, не захватывая осадок и используя для каждого образца отдельный наконечник (без фильтра). К осадку добавить транспортную среду до конечного объема 0,2 мл. Тщательно перемешать содержимое пробирки на вортексе. Предварительно обработанные образцы мочи (осадок мочи в транспортной среде) можно хранить

• при температуре от 2 до 8 °С – в течение суток;
• при температуре не выше минус 20 °С – в течение недели;
• при температуре не выше минус 68 °С – длительно.

Принцип метода экстракции Клинический образец (клинический материал, помещенный в транспортную среду) обрабатывается лизирующим раствором в присутствии частиц силики – сорбента. В результате происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение ДНК. Растворенная ДНК в присутствии лизирующего раствора связывается с частицами сорбента, в то время как другие компоненты лизированного клинического материала остаются в растворе и удаляются при осаждении сорбента центрифугированием и последующей отмывкой. При добавлении раствора для элюции ДНК к сорбенту происходит переход ДНК с поверхности силики в раствор, который отделяется от частичек сорбента центрифугированием. В результате указанной процедуры получается высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции амплификации, что обеспечивает высокую аналитическую чувствительность ПЦР-исследования. Состав комплекта «ДНК-сорб-АМ»