Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза: от гена к признаку

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН была основана в 2006 году. Лаборатория изучает молекулярно-генетические механизмы раннего развития и эволюции нервной системы, а также регенерации на моделях низших позвоночных. Об истории лаборатории и об основных направлениях проводимых в ней исследований читайте в этом материале.

«Био/мол/текст»-2016

Эта работа опубликована в номинации «Места» конкурса «био/мол/текст»-2016.

Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма «Атлас».

Спонсор публикации этой статьи — Дмитрий Геннадиевич Калашников.

Нельзя объять необъятное. В рубрике «Места» мы рассказываем только о внутренней жизни лабораторий и их научной работе. За кадром остаются внешние трудности и конфликты, конкуренция между лабами, сложные политические решения и всё такое прочее.

Наиболее замечательное достижение биологии за последние 100 лет — вывод о том, что подавляющая часть информации об организме закодирована в его геноме в виде линейной последовательности нуклеотидов. Очевидным доказательством этому служит, например, развитие однояйцевых близнецов или клонирование животных путем пересадки ядер, взятых из клеток одного организма, в энуклеированные (лишенные ядра) яйцеклетки других организмов. И в том, и в другом случае получаются особи чрезвычайно похожие друг на друга. Данные примеры демонстрируют, что развитие действительно представляет собой процесс «развертывания» информации, целиком содержащейся в геноме.

Именно этот процесс развертывания информации, записанной в геноме зиготы (оплодотворенной яйцеклетки), в многоклеточные структуры взрослого организма представляет собой основной предмет исследований биологии развития. Понимание механизмов данного процесса крайне важно, поскольку их нарушение часто лежит в основе различных наследственных и приобретенных болезней, в том числе многих типов рака. Также знание этих механизмов необходимо в таких стремительно развивающихся прикладных областях, как регенеративная и репродуктивная медицина. С другой стороны, изучение механизмов, обеспечивающих реализацию генетической информации в эмбриогенезе, важно для понимания фундаментальных принципов организации живой материи и имеет большой общенаучный интерес. Вопрос о том, каким образом из внешне гомогенного яйца получается организм со строго упорядоченной пространственной структурой, представляет собой важнейшую общенаучную проблему, лежащую на стыке интересов биологии, химии, физики и математики. В наиболее общем виде данная проблема может быть сформулирована как вопрос о механизмах динамической самоорганизации. Наша лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза в ИБХ РАН по мере своих скромных сил пытается приблизиться к решению этого вопроса, изучая механизмы раннего развития мозга и регенерации.

Ген, который подарил нам мозг

Одним из отличительных признаков всех позвоночных животных, в том числе и человека, является конечный мозг — передний отдел эмбрионального мозга, из которого развиваются такие важнейшие структуры, как большие полушария головного мозга. Именно большие полушария мы обычно представляем себе, когда говорим о мозге в нашей обыденной жизни. Интересно, что все остальные типы многоклеточных животных, включая ближайших родственников позвоночных — протохордовых (баланоглоссов, ланцетников и оболочников), — не имеют выраженных анатомических структур, гомологичных конечному мозгу позвоночных. Это означает, что конечный мозг возник в эволюции только у предков современных позвоночных. Используя терминологию А.Н. Северцова, его появление можно назвать типичным ароморфозом — крупным эволюционным изменением, приводящим к общему повышению уровня организации организма. В связи с этим очень важен вопрос о генетических механизмах, лежащих в основе данного ароморфоза.

В свое время в нашей лаборатории был открыт моногенный класс гомеобоксных генов, представители которого специфично экспрессируются у всех исследованных позвоночных в клетках зачатка конечного мозга на самых ранних стадиях его развития. В соответствии с названием места экспрессии этих генов — передний валик нервной пластинки (anterior neural fold) — мы назвали открытый класс гомеобоксных генов — Anf [1–3]. Последующие исследования показали важную роль Anf в развитии конечного мозга.

Эта работа началась еще в лаборатории структуры и функции генов человека (СГФЧ) нашего института, бессменным заведующим которой является Евгений Давидович Свердлов, академик, известный исследователь геномов живых организмов и недавний лауреат премии Президента РФ. Туда я пришел после окончания кафедры эмбриологии биофака МГУ. В то время в лаборатории (с подачи одного из основателей ИБХ — Юрия Анатольевича Овчинникова) успешно развивался проект по клонированию Na-К-АТФазы. Им был нужен человек, который мог бы организовать инъекции мРНК в ооциты шпорцевой лягушки с целью получения функционального белка Na-К-АТФазы. В мою скромную задачу входило завести все это лягушиное хозяйство и наладить методику микроинъекций. Поскольку я окончил кафедру эмбриологии и уже тогда имел выраженные интересы в этой области, Евгений Давидович, видимо, почувствовав это, очень мудро разрешил мне заниматься параллельно с основной работой по инъекциям своими эмбриологическими проектами, что я и продолжал успешно делать. Более того, примерно через год мне удалось убедить Евгения Давидовича в том, что мне очень нужен помощник, и пригласить в качестве такового Сергея Лукьянова, который к тому времени тоже окончил кафедру эмбриологии и искал место распределения. Так мы с Сергеем образовали микрогруппу в составе лаборатории СФГЧ.

Постепенно, посещая лабораторные семинары и общаясь с коллегами, мы, эмбриологи, проникались молекулярно-генетическим духом, стараясь применить полученные новые знания к своим эмбриологическим объектам и идеям. Так, однажды, обдумывая результаты одной своей работы по ранней разметке эмбриональной эктодермы на два зачатка — зачаток центральной нервной системы, нервную пластинку и зачаток эпидермиса, — я пришел к выводу, что было бы здорово найти такие гены, которые бы специфично экспрессировались в нервной пластинке, но не в эпидермисе. Найдя такие гены и изучая затем, что заставляет их экспрессироваться подобным образом, можно было бы попытаться, по крайней мере, в этом конкретном случае, ответить на самый важный вопрос биологии развития: каковы механизмы создания пространственной упорядоченности в развивающемся эмбрионе.

Сложность задачи заключалась, однако, в том, что в ту «догеномную эру» еще не было эффективных методов прицельного поиска подобных дифференциально экспрессирующихся генов. Точнее, один метод — вычитающая гибридизация — уже был, но он был разработан для больших количеств тканей. Например, можно было взять несколько граммов ткани печени и столько же мышечной ткани, выделить из них мРНК и затем с помощью вычитающей гибридизации искать те мРНК, которые специфично представлены в печени, и те, которые в мышцах. В нашем же случае необходимо было проделать то же самое на микроколичествах эмбриональной ткани весом не более 100 микрограммов. Дело в том, что ранний зачаток ЦНС у эмбриона шпорцевой лягушки на стадии гаструляции составляет примерно 1/20 часть всего эмбриона, который имеет размер около 1 мм в диаметре. Этот зачаток и его альтернативу — зачаток эпидермиса, можно вырезать под микроскопом микрохирургическими инструментами, однако накопить большое количество таких прицельно вырезанных кусочков эмбриональных тканей практически невозможно.

К счастью, из разговоров в лаборатории и литературы мы узнали о недавно появившемся замечательном методе — полимеразной цепной реакции, — позволяющем амплифицировать даже отдельные нуклеотидные последовательности. Более того, в лаборатории вскоре появился прибор для этого метода — амплификатор фирмы PerkinElmer. Беда, однако, заключалась в том, что тогда не умели получать ПЦР-амплифицированные библиотеки кДНК из таких микроколичеств исходного материала, как было нужно нам. Основной проблемой было быстрое нарастание паразитных продуктов ПЦР — т.н. «бомбы». Если исходного материала было много, то «бомба» не мешала. Однако если исходной кДНК было очень мало (как в нашем случае), то «бомба» полностью подавляла ее амплификацию.

С «бомбой» тогда никто не умел бороться. Случайно, из разговоров в лаборатории я узнал, что муж нашей сотрудницы Татьяны Виноградовой — Александр Белявский — недавно разработал сложный, но эффективный метод борьбы с «бомбой» и опубликовал статью в Nucleic Acids Research, где впервые описал эффективное создание ПЦР-кДНК-библиотек на основе микроколичеств исходной мРНК. Белявский тогда работал у Клауса Раевского в Германии, но иногда наведывался в свой родной Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта в Москве. Через Таню Виноградову я связался с Александром в один из его приездов и рассказал ему о нашей проблеме.

В результате Саша согласился помочь, сказав, однако, что времени у него всего несколько дней, т.к. он должен опять ехать в Германию, и лучше это все сделать в его следующий приезд — через несколько месяцев. Однако нам, конечно, ждать несколько месяцев совсем не хотелось, и мне удалось убедить Белявского начать сразу же. Мы договорились, что к нему в ИМБ приедет Сергей Лукьянов с нашими образцами и рядом с Белявским сам будет делать все операции, точно следуя его инструкциям, а Белявский будет при этом заниматься своими делами. В результате я вырезал по одному фрагменту нервной пластинки и эпидермиса из одного эмбриона шпорцевой лягушки на стадии средней гаструлы, мы их растворили в лизис-буфере, взятом у Белявского, и Сережа поехал.

В итоге им удалось за эти несколько дней и ночей невероятной по напряженности работы не только сделать амплифицированные кДНК-библиотеки, но и провести их вычитающую гибридизацию по методу, на ходу придуманному Белявским. Затем Белявский уехал в Германию, а Сергей вернулся в ИБХ с двумя образцами кДНК, обогащенными, соответственно, нейро- и эпидермис-специфичными последовательностями. Чтобы представить интенсивность этой работы, достаточно сказать, что, по рассказам Сергея, на третью ночь Белявский уже периодически засыпал за работой, и Сереже приходилось его будить, чтобы спросить, как делать очередную стадию. Далее, следуя оставленным Белявским инструкциям и на ходу изобретая свои собственные технологии, Сергей и присоединившийся к нам аспирант лаборатории Чертова, Олег Васильев, провели дифференциальный скрининг плазмидных библиотек, полученных на основе привезенных из ИМБ образцов кДНК.

В результате были найдены два перспективных клона, содержащих вставки генов, потенциально специфично экспрессирующихся в нейроэктодерме и эпидермисе. С последующим сиквенсом этих клонов помог идейно присоединившийся к нам другой сотрудник ИБХ — Юрий Владимирович Смирнов, который в отличие от нас с Сергеем обладал очень ценным качеством: он умел секвенировать . Нужно сказать, что в те времена сиквенс еще делали вручную, и это было большим искусством, которым хорошо владели немногие. В результате с помощью Смирнова мы выяснили, что наши два клона содержат вставки кДНК двух неизвестных генов, один из которых, как раз нейроспецифичный, к нашей радости оказался гомеобоксным, что указывало на его возможную функцию в качестве важного транскрипционного регулятора ранней дифференцировки нейрального зачатка.

В дальнейшем, когда мы проанализировали экспрессию этого гена, оказалось, что он действительно начинает экспрессироваться на самых ранних стадиях дифференцировки нервной пластинки, причем максимум экспрессии соответствовал зачатку наиболее переднего отдела эмбрионального мозга — конечного мозга. Поскольку у лягушки на ранних стадиях развития этот зачаток соответствует переднему валику нервной пластинки, мы назвали новый ген — Xanf, по первым буквам английского Xenopus anterior neural fold. Примечательно, что в то время еще не был разработан метод гибридизации in situ с РНК, который так широко применяется сейчас для изучения генной экспрессии в эмбрионах, и нам пришлось анализировать экспрессию с помощью метода ОТ-ПЦР, вырезая микрообразцы ткани из разных регионов на поверхности эмбриона.

Интересно, что спустя несколько лет, когда экспрессия этого гена была уже проанализирована методом гибридизации in situ, полученная картина в точности совпала с той виртуальной картой экспрессии, которую мы построили на основе данных ПЦР. Результаты всей этой работы мы опубликовали в 1992 году в журнале Developmental Biology [1]. А недавно в разговоре с одним из зарубежных коллег я узнал, что эта публикация имела драматические последствия для одной известной английской лаборатории. Они тогда тоже, но другими методами, клонировали ген Xanf и строили большие планы по дальнейшей работе с ним. Однако выход нашей статьи привел к тому, что группу, занимающуюся данным геном, расформировали, постдоки были перенаправлены на другие проекты, а кому-то даже пришлось отложить защиту диссертации.

Карьерные траектории

Для нас же с Сергеем данная работа послужила своего рода путевкой в научную жизнь. Сергей в процессе всего этого почувствовал большой интерес к разработке молекулярных технологий и, в первую очередь, обратил свой незаурядный талант на создание методов, связанных с ПЦР и вычитающей гибридизацией. В результате размышлений над одним неожиданным эффектом, полученным аспирантом лаборатории СФГЧ Геной Лаунером (сейчас он бросил молекулярную биологию и занимается более надежным делом — добычей золота), Сергей придумал и реализовал знаменитый метод супрессионной ПЦР [7].

В отличие от сложной и многостадийной технологии Белявского, этот метод позволяет легко избежать образования пресловутой «бомбы» и получать кДНК-библиотеки с помощью ПЦР, стартуя с любых микроколичеств исходного материала. На основе этого метода Сергей вместе с Евгением Давидовичем Свердловым создал метод супрессионной вычитающей гибридизации [8]. Именно этот метод составляет основу того комплекса работ, за которые Сергей и Евгений Давидович были награждены в 2016 году Государственной премией.

Осознать важность этих открытий можно также, вспомнив, что сегодня на их основе работают большинство китов фирмы Clontech и Evrogen по всему миру, а основная статья Сергея, который сейчас уже стал академиком и ректором 2-го медицинского университета имени Пирогова, имеет число цитирований по WoS близкое к 3000.

Затем были работы по флуоресцентным белкам из кораллов , иммунологии и много чему еще. Но это — уже другие истории.

Сергей Лукьянов и его коллеги открыли и описали большое число флуоресцирующих и окрашенных белков морских организмов, например, актиний (Anemonia majano и Ricordia yuma) и кораллов. Лукьянова справедливо называли в числе возможных лауреатов Нобелевской премии за GFP, но увы — премию в итоге получил Роджер Тсин: «Флуоресцирующая Нобелевская премия по химии» [9]. Отдел Сергея Лукьянова в ИБХ традиционно очень плотно занимается флуоресценцией, широко используемой в биологических исследованиях по всему миру [10], и его сотрудники опубликовали на «биомолекуле» уже несколько статей по этой теме: «Лучше один раз увидеть, или микроскопия сверхвысокого разрешения», «Флуоресцентный белок miniSOG убивает клетки светом» и «Флуоресцентные белки: разнообразнее, чем вы думали!» [11–13]. — Ред.

Глубже в эмбриогенез

Я же продолжил заниматься механизмами биологии развития и, в конце концов, с подачи и при помощи Евгения Давидовича Свердлова образовал в институте самостоятельную группу, а затем и лабораторию молекулярных основ эмбриогенеза. В настоящее время наша лаборатория разрабатывает несколько относительно независимых проектов, но все они так или иначе касаются раннего развития нервной системы и головного мозга. Один из этих проектов связан с продолжением исследования у позвоночных животных моногенного семейства гомеобоксных генов Anf, основание которому положил ген Xanf, найденный нами у шпорцевой лягушки (рис. 1).

Рисунок 1. Гомеобоксный ген Anf — ключевой регулятор развития конечного мозга. а — Гомеобоксный ген Anf и конечный мозг присутствуют только у позвоночных животных, в том числе у человека, и отсутствуют у всех остальных животных. б — Искусственное изменение уровня экспрессии гомеобоксного гена Anf вызывает изменение размеров конечного мозга у головастика шпорцевой лягушки.

Наши дальнейшие эксперименты показали, что в клетках зачатка конечного мозга белок Anf играет роль специфического репрессора транскрипции, подавляя экспрессию генов, индуцирующих дифференцировку задних отделов мозга [14–18]. Известные мутации в этом гене у мыши и человека имеют рецессивный характер, но в гомозиготном состоянии приводят к серьезным аномалиям развития мозга — от недоразвития гипофиза и септооптической дисплазии (дисплазии оптического нерва и перегородки больших полушарий) до голопрозенцефалии (слияния желудочков конечного мозга) и анэнцефалии (отсутствия структур конечного мозга).

На основании всех этих данных, а также учитывая, что гены класса Anf отсутствуют у всех исследованных беспозвоночных животных, мы предположили, что возникновение этих генов у предков позвоночных могло послужить одной из ключевых предпосылок к возникновению конечного мозга в эволюции [18]. Согласно нашей гипотезе, репрессорная активность Anf в передней части зачатка центральной нервной системы у предков позвоночных обеспечила образование в этом регионе особой зоны, клетки которой оказались свободны от инструктирующего влияния генов, определяющих судьбу более задних регионов нервной системы. В результате эта зона нейрального зачатка, экспрессирующая Anf, получила возможность эволюционировать в новом направлении, что и привело в конце концов к образованию конечного мозга. То есть можно утверждать, что тот мозг, который мы сейчас имеем, и, в частности, наша способность читать и понимать этот текст во многом есть результат появления у предков позвоночных гена Anf.

А что у миноги?

Хотя выдвинутая нами гипотеза хорошо согласуется со многими известными в настоящее время данными, для более полного ее обоснования важно продемонстрировать выполнение такого необходимого условия, как присутствие генов Anf у всех классов позвоночных. К сожалению, до сих пор эти гены не были обнаружены у представителей самой древней группы современных позвоночных — у бесчелюстных (миног и миксин). И это при том, что геном одной из миног был секвенирован и стал недавно доступен для анализа. Как известно, ветвь, ведущая к современным миногам и миксинам, отделилась от общего ствола позвоночных на самых ранних этапах их эволюции — более 500 миллионов лет назад. Поэтому найти и изучить роль Anf у бесчелюстных было бы крайне важно, поскольку это бы означало, что данный класс генов действительно присутствует у самых древних животных, имеющих конечный мозг. Трудность здесь заключается, однако, в том, что геном миноги чрезвычайно богат GC-парами и трудно поддается секвенированию. Иногда даже получение некоторых фрагментов ДНК методом ПЦР представляет собой нетривиальную задачу. Кроме того, минога — достаточно редкий объект, не говоря уже об эмбрионах ранних стадий, на которых и должна предположительно происходить экспрессия Anf, то есть присутствовать его мРНК.

Один из текущих проектов нашей лаборатории посвящен именно поиску и изучению функций гена Anf у миноги. Занимаются этой работой Андрей Байрамов, Галина Ермакова и Федор Ерошкин. В рамках этого проекта для сбора эмбрионов камчатской миноги (одного из наиболее распространенных видов миноги с отсеквенированным геномом) Андрей Байрамов и Федор Ерошкин недавно провели экспедицию на Камчатку. Кроме того, в сотрудничестве с уникальным специалистом по миноге Александром Кучерявым из Института морфологии животных им. А.Н. Северцова удалось наладить непосредственно в нашей лаборатории получение эмбрионов нужной стадии у другого близкого вида — речной миноги. В результате нам наконец-то удалось клонировать гены Anf у этих двух видов миног. Примечательно, что это было сделано как раз с помощью методов, разработанных когда-то для супрессионной гибридизации Сергеем Лукьяновым. Более того, в экспериментах на ранних эмбрионах миноги, полученных в нашей лаборатории, мы экспериментально показали, что Anf у миноги так же, как и у других позвоночных, необходим для развития конечного мозга. Таким образом, нам удалось подтвердить нашу гипотезу о том, что данный гомеобоксный ген действительно присутствует во всех классах современных позвоночных, регулируя у них развитие конечного мозга. В настоящее время статья с описанием этой работы находиться на рецензии в одном из известных международных журналов.

Anf, Ras-dva и другие

Что же касается остальных проектов нашей лаборатории, то они так или иначе связаны (или берут свое начало) с геном Anf, а также с работами, начатыми мной еще в студенческие годы.

Один из таких проектов посвящен изучению роли пропавших в ходе эволюции позвоночных генов в регенерации. В свое время в поисках генных мишеней белка Anf мы наткнулись на довольно необычное явление. Оказалось, что некоторые из найденных генов-мишеней Anf, а именно гены секретируемого фактора Ag1 (рис. 2) и гены малых ГТФаз Ras-dva, присутствуют только в геномах низших позвоночных, рыб и амфибий, но отсутствуют у высших — рептилий, птиц и млекопитающих [19–22]. При этом у низших позвоночных данные гены, кодирующие совершенно разные типы белков, регулируют два важнейших процесса — развитие мозга и регенерацию конечностей [23–25]. Мы предположили, что исчезновение этих генов у высших позвоночных могло быть одной из причин, приведших к снижению у них регенерационных способностей. В то же время такая потеря могла привести к снятию каких-то молекулярных блоков, затрудняющих у низших позвоночных дальнейшее прогрессивное развитие мозга. Как известно, одно из отличий высших позвоночных заключается как раз в сильно развитом, по сравнению с низшими позвоночными, конечном мозге. Другими словами, исчезновение в эволюции найденных нами генов могло быть своеобразной платой, отданной предками высших позвоночных за возможность прогрессивного развития мозга. В ходе работы над данным проектом, которая сейчас успешно продолжается, нам удалось получить данные в пользу этой гипотезы.

Рисунок 2. Инъекции антисмыслового морфолинового олигонуклеотида блокируют трансляцию мРНК гена Ag1 , что приводит к ингибированию регенерации хвостового плавника у рыбы Danio rerio.

Важным результатом этой работы стала гипотеза о том, что и другие крупные эволюционные преобразования, существенно изменяющие развитие организмов, могут быть обусловлены не только перестройками регуляторных сетей, состоящих из одного и того же набора генов (как это, в основном, предполагается сейчас), но также возникновением и потерей, по крайней мере, некоторых важных генов. Но если это так, то идентификация подобных генов могла бы стать эффективным способом выявления генетических основ подобных эволюционных преобразований эмбриогенеза. Основываясь на данной гипотезе, совместно с коллегами из лаборатории Василия Александровича Любецкого Института проблем передачи информации им. А.А. Харкевича мы разработали алгоритм и компьютерную программу, позволяющую на основе сравнения геномов суперкомпьютером идентифицировать гены, возникшие или исчезнувшие на заданном этапе эволюции. С помощью этой программы нам недавно удалось обнаружить еще несколько генов, исчезнувших у высших позвоночных, но принимающих участие в регенерации у рыб и амфибий. Сейчас мы изучаем роль некоторых из этих генов в регенерации и развитии мозга у низших позвоночных. Этим проектом в основном занимаются Мария Терешина (см. видео ниже), Анастасия Иванова, Галина Ермакова и Дарья Короткова, но периодически подключаются и другие сотрудники лаборатории.

На 25-м семинаре Совета молодых ученых ИБХ Мария Терешина рассказала о некоторых генах, отвечающих за регенерацию, которую мы (люди) потеряли

Изучение генной сети, связанной с функционированием гена Anf в клетках раннего зачатка переднего мозга, также привело к открытию ряда других генов, играющих важную роль в эмбриогенезе. Так, нами впервые были открыты и изучены регуляторы раннего развития головного мозга — секретируемые белки Noggin2 и Noggin4 [26–29]. Основные участники данного проекта — Андрей Байрамов, Федор Ерошкин, Алексей Нестеренко, Александр Бородулин, Наталья Мартынова, Галина Ермакова и Евгений Орлов. Было показано, что важным свойством Noggin2 и Noggin4 является способность связывать и ингибировать функцию регулятора задних отделов ЦНС — секретируемого белка Wnt8 (рис. 3).

Рисунок 3. Секретируемый белок Noggin2 ингибирует три сигнальных каскада — BMP, Activin/Nodal и Wnt. Это является достаточным условием для индукции второй головы при искусственно вызванной экспрессии Noggin2 на брюшной стороне эмбриона шпорцевой лягушки.

В совместной работе с сотрудником кафедры биофизики МГУ Алексеем Нестеренко мы разработали на модели белков семейства Noggin и Wnt комплекс методов для изучения диффузии и взаимодействия морфогенов в межклеточном пространстве эмбриональных тканей. В результате впервые удалось измерить коэффициенты диффузии этих белков в живом эмбрионе лягушки (рис. 4) и продемонстрировать важную роль адсорбции на внеклеточном матриксе в их диффузии [29], [30]. В этом исследовании основную работу выполняли Алексей Нестеренко, Александр Бородулин и Евгений Орлов. Кроме того, впервые с помощью математического моделирования было показано, что такая адсорбция может играть роль важного фактора, необходимого для создания пространственно упорядоченных структур в эмбриогенезе.

Рисунок 4. Секретируемый белок Noggin4, флуоресцентно меченный EGFP (EGFP-Noggin4), диффундирует из пересаженного кусочка эктодермы (граница выделена пунктиром), где он экспрессируется, по межклетникам эмбриона-реципиента на большие расстояния. Стрелки показывают направление диффузии.

Эти работы важны, поскольку знание закономерностей адсорбции морфогенных белков на внеклеточном матриксе позволяет строить более реалистичные реакционно-диффузионные модели ранней разметки эмбриона. Общепризнано, что закономерное подразделение эмбриона на территории с разной судьбой дифференцирующихся клеток происходит благодаря возникновению динамических пространственных (диссипативных) структур, возникающих в результате взаимодействий секретируемых белков-морфогенов.

Эти процессы могут быть описаны с помощью систем нелинейных дифференциальных уравнений с диффузией. Показано, что именно в таких динамических нелинейных системах могут возникать стационарные пространственные структуры в виде градиентов концентраций белков-морфогенов. В результате клетки эмбриона, расположенные на определенном расстоянии вдоль такого градиента, получают воздействие соответствующей этому расстоянию концентрации морфогена и таким образом получают импульс к дифференцировке в определенном направлении. Из теории диссипативных структур известно, что одним из условий существования таких структур является наличие в системе, по крайней мере, двух диффундирующих и нелинейно взаимодействующих морфогенов с резко различающимися коэффициентами диффузии. Между тем, все реальные белки-морфогены имеют близкие размеры и, соответственно, примерно одинаковые гидродинамические коэффициенты диффузии. Наша работа показывает, что разница в скоростях диффузии морфогенов может достигаться за счет разной силы их адсорбции на внеклеточном матриксе.

Кроме того, важным итогом этой работы стал вывод о том, что такая адсорбция позволяет существенно увеличить разнообразие форм возможных диссипативных структур на основе диффундирующих морфогенов, что, соответственно, создает предпосылки для развития более разнообразных морфологических форм в эмбриогенезе. В настоящее время направление, связанное с изучением диффузии морфогенов, является одним из основных в нашей лаборатории.

В ходе поиска белков, способных напрямую взаимодействовать с белком Anf, нами был найден еще один интересный для понимания механизмов регуляции эмбриогенеза ген — Zyxin [31]. Ранее белок Zyxin изучался другими авторами исключительно на уровне отдельных клеток, растущих в культуре. Было установлено, что данный белок с одной стороны участвует в сборке актинового цитоскелета, а с другой — способен перемещаться в клеточное ядро, регулируя там экспрессию определенных генов. Поэтому было сделано предположение, что Zyxin может осуществлять связь между клеточными движениями, основанными на перестройках цитоскелета, и генной экспрессией. Помимо взаимодействия с транскрипционным фактором Anf, мы установили, что в эмбрионе на ранних стадиях развития центральной нервной системы Zyxin ингибирует сигнальный каскад, активируемый секретируемыми белками семейства Hedgehog [32]. Полученные данные впервые демонстрируют связь между одним из цитоскелетных белков-регуляторов морфогенетических движений клеток и важным сигнальным каскадом, управляющим дифференцировкой клеток в нейральном зачатке.

В настоящее время мы работаем над проектом по широкомасштабному поиску генных мишеней Zyxin в модельном объекте — раннем эмбрионе шпорцевой лягушки. В основном, этой работой занимаются Наталья Мартынова и Федор Ерошкин. С помощью высокопроизводительного секвенирования мы сравнили транскриптомы нормальных эмбрионов и эмбрионов с заблокированной трансляцией мРНК Zyxin. Данная работа проводилась в сотрудничестве с группой исследователей, возглавляемой Егором Прохорчуком из Центра биоинженерии РАН. Одним из интересных результатов этой работы стало установление того факта, что Zyxin, по-видимому, регулирует экспрессию мастер-генов, определяющих стволовой статус клетки. Учитывая то, что одна из функций Zyxin — регуляция морфогенетических движений, данные о возможной регуляции экспрессии этих генов представляют особый интерес, поскольку они указывают на возможный конкретный путь связи морфогенеза со стволовым статусом клеток.

Проблеме взаимосвязи морфогенеза с регуляцией экспрессии генов и клеточной дифференцировкой посвящен еще один проект, развиваемый в нашей лаборатории Федором Ерошкиным. Выяснение механизмов такой взаимосвязи крайне важно для понимания того, каким образом из отдельных клеток образуется гармонично сложенный многоклеточный орган или даже целый эмбрион. Дело в том, что клеточная дифференцировка в эмбриогенезе происходит на фоне морфогенетических процессов, приводящих к изменению формы эмбриона и его зачатков за счет активных перемещений и переупаковки его клеток. Например, нервная пластинка в ходе нейруляции растягивается в продольном направлении более чем в три раза (рис. 5).

Рисунок 5. В ходе нейруляции зачаток центральной нервной системы — нервная пластинка — сильно растягивается в продольном направлении в результате слаженных морфогенетических движений, слагающих ее из соседних клеток. Показаны три последовательные стадии развития одного и того же эмбриона шпорцевой лягушки. Зеленым цветом отмечены клетки нервной пластинки. Пунктирные линии соединяют одинаковые группы клеток.

В развиваемом в лаборатории проекте мы пытаемся понять механизм обратной связи между механическими напряжениями, возникающими в тканях эмбриона в результате морфогенетических движений клеток, и генной экспрессией в этих же клетках. Предположение о том, что дальнодействующие механические напряжения могли бы играть роль сигнала обратной связи между морфогенетическими движениями клеток и процессами клеточной дифференцировки и, следовательно, генной экспрессией, возникло у меня еще в период работы над дипломной работой на биофаке МГУ, которую я выполнял под руководством Льва Владимировича Белоусова. На основании этой идеи и экспериментальных данных Л.В. Белоусова о феномене контактной поляризации клеток физик-теоретик Борис Николаевич Белинцев предложил теоретическую модель пространственной самоорганизации клеточной дифференцировки в эпителиальных пластах эмбриональных тканей [33].

К сожалению, хотя мы сравнительно легко могли регулировать механические напряжения и анализировать последствия такой регуляции на тканевом уровне с помощью микрохирургической техники, мы не могли целенаправленно искать механо-чувствительные гены, поскольку в то время еще не существовало методов, позволявших делать это на таких микрообъектах, как фрагменты эмбриональных тканей. Примечательно, что именно эта задача стимулировала нас тогда с Сергеем Лукьяновым к разработке подобных методов на модели единичных тканевых фрагментов, вырезанных с помощью микрохирургии из эмбриона шпорцевой лягушки. В результате была создана серия методов вычитающей гибридизации, позволивших нам, в частности, клонировать гомеобоксный ген Anf, о котором говорилось выше. Однако, как выяснилось в процессе этой работы, методы вычитающей гибридизации в принципе не давали возможности уверенно выявлять дифференциально экспрессирующиеся гены, у которых разница в экспрессии между опытным и контрольным образцом была менее десяти раз. А именно к последним, как сейчас выясняется, относятся гены, реагирующие на механические напряжения, и именно поэтому нам тогда не удалось обнаружить подобные гены.

Между тем, современный метод высокопроизводительного секвенирования транскриптомов, в отличие от вычитающей гибридизации, позволяет уверенно выявлять гены, у которых разница в экспрессии между контролем и опытом составляет всего несколько раз. Используя данный метод, нам недавно удалось выявить ряд генов, экспрессия которых регулируется механическими напряжениями, возникающими в раннем зачатке нервной системы в результате движений его клеток. Мы надеемся, что дальнейшее изучение механизмов регуляции экспрессии этих генов позволит понять, каким образом осуществляется обратная связь между полями механических напряжений в эмбриональных тканях и генной экспрессией.

В ходе работы над вышеуказанными проектами наша лаборатория сотрудничает с другими лабораториями нашего института, с кафедрой биофизики МГУ, Центром «Биоинженерия» РАН, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Институтом проблем передачи информации РАН, НИЦ Курчатовский институт, а также с рядом зарубежных лабораторий. Из числа последних наиболее тесное сотрудничество в последнее время развивается с двумя лабораториями в США: профессора Роберта Грейнджера (Robert Grainger) из университета Виргинии и профессора Марка Киршнера (Marс Kirshner) из Медицинской школы Гарварда.

Кроме вышеописанных фундаментально-научных исследований, в нашей лаборатории уже многие годы проводятся работы по созданию новых методик мониторинга различных клеточных процессов в эмбриогенезе с использованием новых флуоресцентных репортерных белков [34–39]. Данные работы проводятся в сотрудничестве с лабораториями биофотоники (заведующий Константин Лукьянов), геномики адаптивного иммунитета (зав. Дмитрий Чудаков) и молекулярных технологий (зав. Всеволод Белоусов). В частности, нами была разработана технология двухцветного репортерного вектора, существенно повышающая эффективность функционального промоторного анализа благодаря возможности сравнивать экспрессионный потенциал двух делеционных мутантов изучаемого генного промотора в одном и том же трансгенном эмбрионе [16].

Еще одна интересная недавняя работа, выполненная совместно с лабораторией Всеволода Белоусова, была посвящена исследованию изменений кислотности цитоплазмы при регенерации хвоста у головастиков шпорцевой лягушки с помощью флуоресцентного pH сенсора Sypher2 [40]. В этой работе нам удалось обнаружить ранее неизвестный эффект — быстрое закисление цитоплазмы клеток вблизи места ампутации хвоста. Этот эффект является одной из первых реакций организма на ампутацию и, вероятно, может иметь важное регуляторное значение для последующей регенерации.

Также в лаборатории проводятся уникальные для нашей страны работы по созданию и поддержанию линий трансгенных лягушек Xenopus laevis (рис. 6), экспрессирующих флуоресцентные репортеры и сенсоры (ответственные: Галина Ермакова, Елена Соловьева, Марина Серебрякова и Елена Радзиховская). Эмбрионы, получаемые от таких лягушек, находят применение во многих исследованиях по биологии развития.

Рисунок 6. Аквариальная комната , где содержатся лягушки и головастики некоторых трансгенных линий, а также взрослые лягушки, экспрессирующие флуоресцентные белки под контролем промоторов различных генов.

Итак, начав с открытия одного из главных регуляторов раннего развития конечного мозга — гомеобоксного гена Anf, и занимаясь затем изучением генов, входящих в его регуляторную сеть, нам удалось выяснить некоторые важные механизмы раннего развития и эволюции мозга позвоночных, а также приблизиться к пониманию причин снижения в ходе эволюции регенерационных способностей. Кроме того, данные исследования позволили заложить основы для нескольких новых направлений, которые, как мы надеемся, приведут к еще более интересным результатам. Таким образом, можно сказать, что ген Anf, создавший в ходе эволюции условия для возникновения конечного мозга у позвоночных, неожиданным образом сыграл важную роль и в нашей скромной судьбе, позволив состояться как ученым.