Как определить сайты связывания промотора?

Я пытался выяснить, какой сигма-фактор ответственен за транскрипцию субъединиц РНК-полимеразы α α (rpoA) и β ' β ' (rpoC) в Bacillus subtilis . Я ожидаю, что это будет уборка σ σ , Однако из базы данных транскрипционных факторов Bacillus subtilis я узнал, что σ σ сайты связывания были обнаружены в промоторах β β (rpoB) и δ δ (rpoE) субъединицы и целый ряд альтернативных σ σ факторы, но это ничего не говорит о α α или β ' β ' ,

Поэтому я хочу знать, есть ли способ узнать это, не входя в мокрую лабораторию!

В первую очередь; откуда мы знаем, что что-то является сайтом связывания транскрипционных / сигма-факторов? Что это о регионе? И как мы узнаем, для какого TF / SF это сайт связывания? Может ли один и тот же фактор транскрипции / сигмы иметь несколько разных мотивов сайта связывания?

Во-вторых, Поскольку геном B. subtilis доступен, смогу ли я выяснить мотивы сайтов связывания для всех сигма-факторов, а затем определить, какие из них содержатся в промоторе для α α субъединица? Т.е. если я знаю последовательность TF / SF, есть ли способ узнать, с какими промоторами она может связываться?

В заключение; Основная цель этого вопроса - выяснить, как транскрибируется rpoA, и я знаю, что в целом для бактерий требуются сигма-факторы для специфической инициации транскрипции, но может ли быть так, что транскрипция rpoA неспецифична и что сигма-фактор просто не участвует в его транскрипции?

Пожалуйста, дайте мне знать, если я могу что-то сделать, чтобы улучшить свой вопрос, я могу предоставить ссылки, если это будет хорошей идеей. Благодарность!

canadianer

У меня нет однозначного ответа, но, возможно, я могу предложить некоторое понимание. Учитывая необходимую функцию rpoA, я был бы готов поспорить, что SigA является фактором, ответственным за ее транскрипцию, поэтому я сосредоточу свое обсуждение там.

Прогнозирование промоторов без экспериментов может быть очень сложным, учитывая их огромную изменчивость. Идеализированный основной промотор состоит из области -10, спейсера и области -35. Распознавание промотора по сигма-фактору осуществляется в областях -10 и -35: каждый сигма-фактор распознает различную консенсусную последовательность. Bacillus subtilis SigA распознает консенсусные последовательности TTGACA (-35) и TATAAT (-10). Ключевое слово, однако, существует консенсус, поскольку редко, когда промотор действительно содержит эти точные последовательности. В действительности совпадение 3/6 нуклеотидов можно считать разумным. Между областями -10 и -35 находится спейсер с сохраненной длиной. В отсутствие активаторов транскрипции SigA требует 17 +/- 1 нуклеотидного спейсера. Это связано с термодинамическими ограничениями. Вкратце, плавление промотора (при -10) зависит от угла между областями -10 и -35. Учитывая спиральную природу ДНК, этот угол в свою очередь зависит от расстояния между областями -10 и -35. Если угол только правильный, раскручивание ДНК для выравнивания элементов промотора и, таким образом, позволяет сигма-связыванию обеспечивает энергию для расплавления промотора. Если угол слишком велик, регионы никогда не смогут выровняться. Если угол мал, выравнивание не даст достаточно энергии для плавления. Это осложняет нестандартные основные промоторы и различные фланкирующие последовательности, которые все играют роль в инициации транскрипции. Как прямой ответ на один из ваших вопросов, один сигма-фактор может связываться со многими различными последовательностями ДНК с некоторыми консервативными областями.

К счастью, геном B. subtilis был секвенирован. Ваш поиск промотора может включать поиск областей -10 и -35 5 'по гену rpoA. Это, однако, не учитывает, что rpoA может быть частью полицистронного оперона и, таким образом, под контролем промотора далее по течению. Suh et al. (1986) сделал в основном это и сообщил:

Наш анализ последовательности ДНК предполагает дальнейшие эксперименты по изучению регуляции в области rpoA. Поскольку ингибирование трансляции поликистронных сообщений свободным белком S4 является одним из главных контролей экспрессии альфа-оперона в E.coli (16, 23), очевидное отсутствие S4 в альфа-области B. subtilis предполагает различную регуляцию. Хотя тесная связь генов rpsM и rpsK в нашей последовательности (рис. 3) подтверждает идею трансляционного связывания, сходного с E.coli, предполагаемые промоторы rpoA на относительно большом межцистронном расстоянии после rpsK также различны (28, 29 ). Однако явное отсутствие rho-независимого терминатора в этой области может указывать на то, что значительная транскрипция происходит от дополнительных восходящих промоторов в B. subtilis, а также в E.coli (28).

Хотя это старая статья, но я не смог найти более свежие исследования в моем быстром исследовании. В основном они сравнили ген rpoA B. subtilis с геном Escherichia coli , где он расположен в опероне с рибосомными белками rpsM, rpsK, rpsD и rplQ (под контролем одного промотора). Они нашли как сходства, так и различия. Им удалось найти два возможных коровых промотора SigA в области между rpoA и rpsK (следующий ген от 5 'до rpoA в B subtilis ). Также было относительно большое расстояние между двумя генами, что позволяет предположить, что они не являются частью одного и того же оперона. Кроме того, они смогли найти сайт связывания рибосомы (последовательность Шайна-Далгарно) между гипотетическими промоторами и сайтом начала трансляции. С другой стороны, между rpsK и rpoA отсутствует терминатор транскрипции, что свидетельствует о том, что промотор дополнительно регулирует экспрессию rpoA в восходящем направлении. После анализа последовательности они предположили, что необходимы дальнейшие эксперименты.

В заключение, трудно найти промоутеров, просто взглянув на последовательность. Даже если вы найдете возможного промоутера, невозможно сказать, используется ли он без экспериментов. Тем не менее, учитывая, что альфа-субъединица необходима для клеточной функции, что ген rpoA, по-видимому, транскрипционно связан с рибосомными белками (которые также необходимы для клеточной функции) и что SigA является преобладающим фактором в log log B. subtilis , I чувствую, что очень вероятно, что SigA в конечном итоге является фактором, ответственным за экспрессию rpoA

Я также подумал, что упомяну, что существуют различные инструменты онлайн-биоинформатики, которые пытаются предсказать промоутеров, но я не буду комментировать их больше, потому что я их не использовал.