научная статья по теме ТРАНСГЕННЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ, СИНТЕЗИРУЮЩИЕ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В ТЕРАПИИ Биология

Текст научной статьи на тему «ТРАНСГЕННЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ, СИНТЕЗИРУЮЩИЕ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В ТЕРАПИИ»

ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 1, с. 66-72

= ЭМБРИОГЕНЕЗ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ :

ТРАНСГЕННЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ, СИНТЕЗИРУЮЩИЕ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В ТЕРАПИИ

Учреждение Российской Академии Наук Институт биологии гена РАН 117984 Москва, ГСП-1, ул. Вавилова, д. 34/5 2 ООО "Институт медицины и трансплантации клетки" 105082 Москва, ул. Большая Почтовая, д. 36, стр. 5 E-mail: lkorochkin@mail.ru Поступила в редакцию 12.10.10 г. Окончательный вариант получен 27.07.11 г.

В лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН под руководством член-корр. РАН Л.И. Корочкина на протяжении многих лет проводились исследования проблем, связанных с развитием нервной системы, дифференцировкой нервных клеток и возможностями применения генных и клеточных технологий для лечения нейродегенеративных заболеваний. Результаты этих исследований, подтверждают перспективность применения трансгенных нейротрофических факторов и белков теплового шока в качестве нейропротекторов в клеточной терапии. Показана перспективность применения промотора гена белка теплового шока HSP70 дрозофилы для создания терапевтических трансгенных конструкций. Дальнейшее совершенствование техники невируснго переноса терапевтических генов и создание многокомпонентных генетических конструкций, которые содержат несколько терапевтических факторов, усиливающих действие друг друга, позволят создавать эффективные клеточные препараты для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Ключевые слова: эмбриональные нейральные клетки дрозофилы, нейральная дифференцировка, глиальный рубец, трансплантация, спинальный ганглий, нейротрофические факторы, трансгенные клетки.

В лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН под руководством член-корр. РАН Л.И. Корочкина на протяжении многих лет проводились исследования проблем, связанных с развитием нервной системы и дифференцировкой нервных клеток, а также потенциалом стволовых/прогениторных клеток и возможностями их применения для лечения нейродегенеративных заболеваний. Первое упоминание понятия "стволовая клетка" можно отнести к 1908 году, когда А.А. Максимов предложил концепцию стволовой клетки для кроветворной ткани. За более чем 100 лет исследователи дали определение эмбриональной стволовой клетке (Stevens, 1970), затем обнаружили, что существуют региональные стволовые клетки, и в конечном итоге была составлена ныне существующая классификация видов стволовых клеток. Новый интерес к данному направлению был спровоцирован обнаружением стволовых клеток в головном мозге млекопитающих, включая человека. Появилось предположение о возможности использования стволовых клеток для введения их в зону пораженного органа человека в целях замещения погибших клеток и/или повышения жизнеспособности клеток окружающей ткани. В 1998 г. была осуществлена пересадка нейральных ство-

ловых клеток человеку после инсульта, а в 2001 г. Филипп Менаш произвел пересадку аутологич-ных скелетных миобластов больному с инфарктом миокарда (Роше! е! а1., 2001). С этого момента начался новый этап исследований, связанных с использованием стволовых и прогениторных клеток в регенеративной медицине. Л.И. Короч-кин с сотрудниками своей лаборатории, а также в сотрудничестве с другими российскими и зарубежными лабораториями принял активное участие в развитии этого перспективного направления. Исследования головного мозга позволили ему сделать предположение, что нейрогенез клеток-предшественников зависит от трех условий: 1) от экспрессии собственных генов и от экспрессии генов окружающих клеток; 2) от ниши, в которой поддерживается стволовой статус клетки (эффект ниши); 3) от гормонального статуса организма. Корочкиным был предложен новый принцип выбора пути дифференцировки проге-ниторными клетками, так называемый "принцип качелей" (Корочкин, Михайлов, 2000). Схема клеточной дифференцировки по Уоддингтону основана на последовательном и однонаправленном сужении проспективных потенций, тогда как Л.И. Корочкин предложил модель ступенчатого

выбора направления дифференцировки, назвав его принципом "качелей". Каждая клетка-предшественник по его теории, опираясь на три вышеописанных условия, выбирает свой путь не прямолинейно, а испытывая колебания в начале каждого этапа развития с последующим сужением набора экспрессируемых тканеспецифичных генов (Корочкин, Михайлов, 2000). Клетка дочерняя по отношению к нейральной стволовой, выйдя из ниши некоторое время экспрессирует маркеры как глиальных так и нейрональных предшественников. Затем, выбрав нейрональный путь развития, она прекращает экспрессию гли-альных маркеров, став нейробластом. По окончании миграции, в начале этапа окончательной дифференцировки нейробласт может снова испытывать колебания экспрессии генов. На ранних стадиях дифференцировки в нейрональном прогениторе активны системы генов, которые ответственны за формирование нейронов различных типов. При этом клетка вступает во взаимодействие с ближним и дальним окружением, которые влияют на дифференцировку и блокируют активность "ненужных" генетических каскадов, за исключением одного, который и необходим для конкретного типа нейронов. Например, дифференцирующийся в адренэргическом направлении нейробласт сначала содержит как мРНК, кодирующую белок, свойственный этому типу нервных клеток, так и мРНК, обслуживающую холинэргический путь развития, и только в конце процесса дифференцировки ферменты холинэр-гического каскада исчезают (Корочкин, Михайлов, 2000). Корочкин неоднократно подчеркивал огромную роль в управлении дифференцировкой ключевых генов, от которых зависит специфика развития определенной ткани или органа ("гены-господа" по Корочкину), которые запускают каскады структурных генов ("гены-рабы" по Короч-кину), обеспечивающих синтез тканеспецифич-ных белков (Корочкин, 2004). Очевидно, что индивидуальное развитие регулируется иерархически организованной системой генов. Таким образом, изменение экспрессии ключевого гена может изменить дифференцировку не только клетки, но и всей ткани. На основании изложенных выше теоретических предпосылок в лаборатории Л.И. Корочкина была выделена новая аллель гена Notch — Notch84k35, специфическим морфогенетическим проявлением которого является нейрогенная трансформация не только вентральной, но и дорзальной эктодермы (Koroch-kin, et al., 1991; Ivanov et al., 1993). В результате этого вся эктодермальная закладка трансформируется в нервную ткань. Гигантская нервная система мутантных эмбрионов Notch84k35 позволяет использовать их в экспериментах по трансплантации с минимальной долей клеток других гисто-типов (Ivanov et al., 1993).

При исследовании межклеточных взаимодействий и процессов развития нервной системы успешно используются методы ксенопластиче-ских трансплантаций. Однако в большинстве работ такого рода применяются трансплантации между видами, принадлежащими к одному роду или семейству. До настоящего времени была предпринята только одна попытка совместить нейральные закладки филогенетически удаленных организмов, которые характеризуются разными стратегиями поведения (Савельев, Корочкин и др., 1990). В этой работе провели трансплантацию нервной ткани дрозофилы в мозг амфибий для исследования дифференцировоч-ного потенциала донорской ткани. В качестве донорской ткани использовали вентральную нейро-генную закладку мутантов Notch Drosophila melano-gaster. В качестве реципиентов были использованы зародыши сибирского углозуба Hynobius keyseplingi и шпорцевой лягушки Xenopus laevis на ст. 20—22 и ст. 20—23 соответственно. Гистологический анализ показал, что в большинстве случаев трансплантат локализовался в полости III-го желудочка головного мозга амфибий, прошедших метаморфоз. Лучше всего трансплантаты выживали и дифференцировались в нервной трубке зародыша сибирского углозуба. В желудочках мозга трансплантированные клетки нейральной закладки дрозофилы дифференцировались и образовывали несколько типов морфологических структур. Наиболее характерным было формирование в трансплантате выраженного нейропиля. Нейро-пиль образовывали отростки, выходящие из небольших скоплений клеток. Как во внутренней части, так и на краях трансплантатов возникали ганглиеподобные структуры. Отдельные клетки трансплантата проникали в мозг реципиента и дифференцировались. При этом нервные клетки дрозофилы сохраняли заданные генотипом морфологические особенности (Корочкин, 1992; Савельев и др., 1991; Савельев, Корочкин и др., 1990). У лягушек, обладающих химерным мозгом, повышалась способность к обучению в тесте на выход из лабиринта (Савельев и др., 1991; Saveliev et al., 1997).

Успешные ксенотрансплантации клеток дрозофилы в мозг амфибий стимулировали эксперименты по трансплантации их в мозг млекопитающих — мышей и крыс. Прежде всего, было необходимо разработать простой и эффективный метод идентификации клеток дрозофилы в мозге реципиента. Для этой цели в линии дрозофилы, используемые для ксенотрансплантации и содержавшие мутантные гены Notch или Delta (с идентичным эффектом на процессы нейрогенеза у мухи), методом микроинъекций в развивающиеся яйца была введена конструкция с геном бактериальной галактозидазы (lacZ), продукт которого может быть выявлен с помощью специальной

окраски. Этот ген был поставлен под контроль промотора гена белка теплового шока дрозофилы, так что репортерный ген автоматически активировался при температура тела млекопитающих. Таким образом, были подготовлены условия для проведения экспериментов по введению эмбриональных нейральных тканей дрозофилы в мозг млекопитающих. Предварительные эксперименты показали, что трансплантируемый материал выживал в тканях мозга млекопитающих, однако в отличие от эксперимента с амфибиями клетки дрозофилы постепенно исчезали, так что через месяц обнаруживались лишь единичные клетки трансплантата. Корочкин предложил использовать эмбриональную нервную ткань дрозофилы в качестве носителя трансгенных конструкций для клеточной терапии

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎