Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему: Селенсодержащие металлокомплексные соединения при острой экзогенной гипоксии
Автореферат диссертации по медицине на тему Селенсодержащие металлокомплексные соединения при острой экзогенной гипоксии
На правах рукописи
СОСИН Денис Владимирович
СЕЛЕНСОДЕРЖАЩИЕ МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ПРИ ОСТРОЙ ЭКЗОГЕННОЙ ГИПОКСИИ
14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология; 14.03.03 - патологическая физиология
Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
доктор медицинских наук профессор Андрей Викторович Евсеев доктор медицинских наук профессор Петр Дмитриевич Шабанов
Барнаулов Олег Дмитриевич, доктор медицинских наук, ФГБУН «Институт мозга человека», лаборатория нейрофизиологии мышления, ведущий научный сотрудник
Петров Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУН «Институт токсикологии» Федерального медико-биологического агентства, лаборатория психофармакологии, заведующий Денисенко Наталья Петровна, доктор медицинских наук, ГБОУ ВПО «Северо-западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова», МЗ РФ, кафедра патологической физиологии, профессор
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации
Защита состоится « 16 » июня 2015 г. в 13-00 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.07 на базе ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова» МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке и на сайте ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова» МО РФ www.vmeda.org, на сайте ВАК Министерства образования и науки РФ www.vak.ed.gov.ru
Автореферат разослан 13 марта 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук профессор Богомолов Борис Николаевич
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Проблема защиты организма от последствий, вызываемых острым недостатком кислорода (02), была и остаётся актуальной для фармакологии, патофизиологии и медицины экстремальных состояний. Гипоксия, независимо от происхождения, может выступать в качестве ключевого фактора формирования многих патологических состояний и заболеваний (Шабанов П. Д. и соавт., 2010; Лукьянова Л. Д., Кирова Ю. И., 2011).
Как известно, человек наиболее часто ощущает на себе воздействие острой гипоксии, имеющей экзогенный характер, обусловленной быстрым снижением содержания 02 в среде обитания или же в составе используемой для дыхания газовой смеси. В экстремальных условиях острая экзогенная гипоксия может развиваться при подъёме на большие высоты, в глубоководных аппаратах, в герметичных помещениях при нарушении работы систем, обеспечивающих подачу воздуха или его регенерацию.
Установлено, что высокий уровень организации ЦНС предопределяет более острый тип реагирования млекопитающих на гипоксическое воздействие в сравнении с млекопитающими, обладающими сравнительно низким уровнем организации ЦНС (Евсеев А. В. и др., 2008; Phillips К., 2004). В частности, имеются сведения, убедительно свидетельствующие о том, что в процессе острого нарастания дефицита 02 в окружающей среде нервные клетки коры головного мозга приматов ярко реагируют даже на незначительное снижение напряжения газа в цереброспинальной жидкости. Если же происходит значительное понижение содержания кислорода, то в нейронах формируются грубые морфологические изменения необратимого характера (Дробленков А. В. и др., 2013; Zhou J. et al., 2009).
В настоящее время считается общепризнанным, что механизмы адаптации при развитии острой экзогенной гипоксии наряду с положительными влияниями на компоненты наиболее лабильных функциональных систем организма (функциональная система кровообращения, функциональная система дыхания) в то же время могут инициировать каскады параллельных негативных реакций. По этой причине в качестве суммарного показателя резистентности организма к остро формирующемуся кислорододефищпу нередко используют показатель продолжительности жизни (выживаемости) (Лукьянова Л. Д., 2004, 2011а, Wilder R. L., 2009).
К перспективным способам повышения выживаемости организма в условиях острой экзогенной гипоксии относят комплекс мероприятий по снижению физической активности индивидуума с целью экономии расходов наличных экзогенных и эндогенных кислородных резервов (Зарубина И. В., 2011). Как показали опыты на животных, той же цели можно добиться посредством фармакологических веществ из категории антигипоксантов, эффекты которых обеспечивают лимитирование метаболических процессов в организме и, в первую
очередь, энергосинтетических реакций митохондриального компартмента (Андреева Н. Н„ 2009; Новиков В. Е. и др., 2010; С11ап<1е1 N. Б., 2010).
Несмотря на неоспоримые достижения современной фармацевтической науки, предлагающей широкий спектр препаратов антигипоксической направленности действия, до сих пор в реестре лекарственных средств отсутствуют высокоэффективные вещества, своевременное применение которых способно существенно смягчить последствия воздействия острого гипоксического состояния (Шабанов П. Д. и др., 2010).
Перечень потенциальных корректоров острых гипоксий по большей части включает антигипоксические вещества с метаболическим типом действия, многие из которых, в свою очередь, являются представителями аминотиолов -гутнмин, амтизол, зтомерзол, метапрот и др., которые были разработаны в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ в разные годы. Названные химические соединения не только способны предупреждать нарушения энергетического обмена, но также могут смягчать их последствия за счёт повышения резистентности хлеток входящих в состав жизненно важных органов и тканей к дефициту 02 и прочим воздействиям, дестабилизирующим энергетический обмен (Шабанов П. Д. и соавт., 2005; Новиков В. Е., Левченкова О. С., 2012).
Степень разработанности темы исследования
В последнее время обнадёживающие перспективы для поиска высокоэффективных антигипоксантов обозначились в связи с возможностью использования для профилактики осложнений остро протекающих гипоксических состояний комплексных соединений металлов с биоантиоксидангами. Синтез такого рода веществ впервые был осуществлён доктором химических наук Э. А. Парфёновым в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра РАМН. Исследования показали, что металлокомплексные антиоксиданты обладают более высокой биологической активностью и биодоступностью, чем «классические» биоантиоксиданты, при широком спектре фармакологических эффектов, включая и антигипоксический (Евсеев А. В., 2008; Катунина Н. П., 2012). Защитный эффект соединений из этой кате горки был продемонстрирован на различных моделях острой гипоксии, в том числе и экзогенных вариантах кислородной недостаточности, причём наиболее существенные результаты были достигнуты в ходе применения цин-ксодержащих веществ (Катунина Н.П., 2012).
В 2009 г. Э. А. Парфеновым были синтезированы металлокомплексные соединения, содержащие в составе лигавда селен. Известно, что селенсодержа-щие вещества благодаря их высокой электронодонорной активности, способны инактивировать свободные радикалы и ферменты, приводящие к их накоплению. Селен был выявлен в составе активного центра глутатионпероксидазы, восстанавливающей перекиси липидов и другие легкоокисляемые метаболиты до нетоксичных гидроксисоединений. Также установлено, что селен способствует трансформации метионина в цистеин и активирует синтез глутатиона, что
в значительной степени повышает общий антиоксидантный потенциал организма и улучшает процесс детоксикации гидроперекисей гашидов (Федин А.И., Румянцева СЛ., 2007; Jin L. Е. et al., 2013). Общеизвестно, что селен как микроэлемент входит в состав ряда поливитаминно-минеральных комплексов.
Следует подчеркнуть, что возможности фармакопрофилактики и лечения нарушений, связанных с формированием острой гипоксии существенно ограничиваются способами введения антигипоксантов (лекарственной формой). На сегодняшний день предлагаются исключительно лекарственные формы для парентерального введения, что затрудняет оперативное применение веществ в экстремальных условиях.
Таким образом, проблема поиска и изучения высокоэффективных антиги-поксических средств для фармакологической коррекции последствий, обусловленных экзогенными формами острой гипоксии, может быть реализована в комплексном исследовании, включающем изучение патофизиологии острых экзогенных гипоксических состояний и их терапии селенсодержащими металло-комплексными соединениями.
Изучить физиологические и патофизиологические изменения состояния жизненно важных систем организма (кровообращения, дыхательной, нервной) при формировании острой экзогенной гипоксии с целью их фармакологической протекции новыми селенсодержащими металлокомплексными соединениями антигипоксической направленности.
1. Изучить особенности изменения электрической активности миокарда (крыса, кошка, лягушка) и внешнего дыхания (крыса) в условиях формирования острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией.
2. В скрининговых опытах на мышах изучить фармакодинамические эффекты 9 новых селенсодержащих металлокомплексных (Zn2+) соединений после их энгералъного и парентерального введения (вне влияния гипоксического фактора, в условиях острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной гипобарической гипоксии) в сравнении с классическими антигапоксантами (мексидол, амтизол, метапрот).
3. В опытах на мышах и крысах установить величины средней летальной и средней эффективной доз для наиболее активных селенсодержащих металлокомплексных (Zn2+) соединений.
4. Изучить влияние наиболее активных селенсодержащих металлокомплексных (Zn2+) соединений на условнорефлекгорную деятельность мышей и стандартный энергетический обмен крыс вне влияния гипоксического фактора, а также на электрическую активность миокарда и показатели внешнего дыхания у крыс в условиях острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией.
5. В опытах ex vivo изучить влияние наиболее эффективных при острой экзогенной гипоксии селенсодержащих металлокомплексных соединений (Zn *) на механическую и электрическую работу изолированного сердца лягушки.
6. Изучить влияние наиболее эффективных при острой экзогенной гипоксии селенсодержащих металлокомплексных (Zn2+) соединений на параметры корковых вызванных потенциалов соматосенсорной коры головного мозга кошек в условиях периодической дыхательной асфиксии и в условиях острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией.
Впервые осуществлён системный анализ данных, характеризующих особенности формирования острого экзогенного гипоксического состояния с учётом показателей электрической активности миокарда, внешнего дыхания, скорости потребления 02, параметров корковых вызванных потенциалов соматосенсорной коры. Изучено влияние 9 новых оригинальных селенсодержащих металлокомплексных (Zn2+) соединений на показатели устойчивости мышей к острой экзогенной гипоксии (острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной гипобарической гипоксии). Впервые продемонстрирован выраженный гипотермический и антигипоксический эффект химических соединений после их применения внутрь для обеспечения устойчивости животных к острой экзогенной гипоксии. Установлено, что металлокомплексные соединения 7tQ1983 и jrQ2170 после их парентерального и энтерального введения мышам на обеих использованных в скрининге моделях острой гипоксии демонстрируют существенный антигипоксический защитный эффект, причем после введения внутрь эффекты селенсодержащих антигипоксантов превышали таковые веществ сравнения - амтизола, мексидола, метапрота. В опытах на мышах и крысах выявлена сравнительно невысокая токсичность вещества jcQ1983 при относительно высокой токсичности соединения vtQ2170. В опытах на мышах, выполненных на модели избегательного оборонительного условного рефлекса, выявлено обратимое негативное влияние вещества 7tQ1983 и антигипоксанта амтизола на моторные реакции животных. В ходе анализа электрической активности миокарда и показателей внешнего дыхания крыс установлено, что вещество 7iQ1983 в условиях острой экзогенной гипоксии продлевает период относительного благополучия в большей степени, чем вещество сравнения -антигипоксант амтизол. Установлены параметры стандартного энергетического обмена у крыс на фоне действия селенсодержащего металлокомплексного соединения 7TQ1983 и антигипоксанта амтизола. Доказано, что вещество 7tQ1933 значительнее уменьшает энергетический обмен, чем вещество сравнения амтизол. В опытах, выполненных ex vivo на изолированном нефиксированном сердце лягушки, подтверждено прямое влияние вещества 7tQ1983 на механическую и электрическую работу сердечной мышцы, проявляющееся отчётливым кар-диодепрессивным эффектом, способствующим увеличению
продолжительности функционирования миокарда в условиях его стимуляции адреналином. По результатам регистрации функционального состояния нейронов соматосенсорной коры установлено, что вещество 7tQ1983 при введении внутрь существенно повышает устойчивость нервных клеток кошек к периодической асфиксии, а также к плавно нарастающей острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией.
Научно-практическая значимость Значение исследования определяется разработкой новых способов моделирования острых гипоксических состояний у животных, оценкой состояния жизненно важных систем организма (система кровообращения, дыхательная система, ЦНС) при развитии острой экзогенной гипоксии и поиском высокоэффективных антигипоксических средств среди новых селенсодержащих металло-комплексных соединений на различных моделях острой экзогенной гипоксии. Способами моделирования острых экзогенных гипоксических состояний у животных служили острая экзогенная гипоксия с пшеркапнией (мышь, крыса, кошка), острая экзогенная гипобарическая гипоксия (мышь). Оригинальность и новизна проведенного комплекса исследований, а также данные, полученные по итогам изучения нового ангигипоксического вещества л01983, представляющего собой комплексное соединение замещённого 3-гидроксипиридина^и диорганодихалькогенида, содержащего в качестве переходного металла Ъа. , подтверждена 3 патентами РФ на изобретение (№ 2291498 от 10.01.2007 г., № 2472503 от 20.01.2013 г. и № 2479871 от 20.04.2013 г.) и 4 рационализаторскими предложениями. На основе выявленных механизмов формирования острого гипоксического состояния экзогенной природы представляются реальными перспективы внедрения нового высокоактивного антигипоксанта *С>1983 (гексакис (3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридинато) [трис (дибензилдиселенидо)] дицинк (II) пентадекасемигидрат) в клиническую практику в качестве средства защиты миокарда и головного мозга от острой гипоксии.
Использование комплексного подхода в изучении фармакологических свойств новых перспективных антигипоксантов в ходе выполнения экспериментов на животных, отличающихся уровнем организации ЦНС (мыши, крысы, кошки) позволяет с высокой степенью надёжности экстраполировать полученные данные на общие закономерности функциональной деятельности гомео-статических систем организма человека.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. В эксперименте моделируются разные варианты острой экзогенной гипоксии. В условиях формирования острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией у крыс при наличии воздушного резерва в 1 л продолжительность жизни по данным регистрации ЭКГ и пневмобарограмм составляет в среднем 46-54 мин. с периодом относительного благополучия в 15-20 мин., что сопоставимо с соответствующим показателем для мышей (соответственно 28-36 мин. и 10-14 мин.) при наличном резерве воздуха в 0,25 л (по данным литературы). В той же модели у крыс при наличии воздушного резерва в 1 л скорость потребления кислорода на начальном этапе составляет 4,5 мл/мин и снижается к концу эксперимента в 3,6 раза. Гибель животных наступает при конечной концентрации кислорода 10,3%. Вариантом циркуляторной гипоксии можно рассматривать модель изолированного сердца лягушки, стимулируемого адреналином, что обеспечивает максимальную частоту и амплитуду сокращений через 6-8 мин. после
аппликации гормона в течение 10-12 мин. при сохранении функциональной активности в среднем на протяжении 28 мин.
2. У 2-х из 9 изученных новых селенсодержащих металлокомплексных соединений, а именно веществ tcQ1983 и tcQ2170, на моделях острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией, острой экзогенной гипобарической гипоксии и острой циркуляторной гипоксии выявлена выраженная антигипоксическая активность как после внутрибрюшинного введения, так и введения внутрь.
3. По показателям средней летальной и средней эффективной доз, рассчитанных для веществ ?rQ1983 и 7rQ2170, установлено, что первое из веществ может быть отнесено к категории относительно безопасных веществ, в то время как второе соединение является высокотоксичным.
4. Вещество JtQ1983, введенное в/б и внутрь в дозе 100 мг/кг в опытах на мышах, подвергнутых воздействию острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией и острой экзогенной гипобарической гипоксии, в большей степени повышает резистентность к указанным видам экзогенной гипоксии, чем препараты сравнения (мексидол, метапрот, амтизол), использованные в той же дозе.
5. Вещество jcQ1983, как и эталонный антигипоксант амтизол, является антигипоксантом метаболического типа действия, что подтверждено негативным влиянием металлокомплексного соединения на величину стандартного энергетического обмена у крыс, динамику потребления крысами кислорода в условиях острой экзогенной гипоксии без гиперкапнии, а также снижением параметров внешнего дыхания и электрической активности миокарда в опытах in vivo и ex vivo.
6. В условиях периодической дыхательной асфиксии, а также при развитии острой гипоксии с гиперкапнией профилактическое введение вещества 7tQ1983 кошкам защищает головной мозг от гипоксии, значительно удлиняя период активного функционирования коры головного мозга, оцениваемого по динамике соматосенсорных вызванных потенциалов.
Методология и методы исследования
Методология исследования сводилась к изучению физиологических и патофизиологических изменений состояния жизненно важных систем организма (кровообращения, дыхательной, нервной) при формировании острой экзогенной гипоксии с целью их фармакологической коррекции новыми селенсодер-жащими металлокомплексными соединениями антигипоксической направленности. В качестве объекта исследования использованы лабораторные грызуны (крысы, мыши), лягушки и кошки, отличающихся уровнем организации ЦНС. Использованные модели острой гипоксии включают острую экзогенную гипоксию с гиперкапнией, острую экзогенную гипобарическую гипоксию и острую циркуляторную гипоксию. Фармакологический анализ проведен с использованием 9 новых селенсодержащих металлокомплексных соединений и 3 препаратов сравнения (амтизол, мексидол, метапрот). Выявлены два наиболее активных соединения (jiQ1983 и 7tQ2170), с помощью которых проведены более де-
тальные исследования их ашигипоксической, эрготропной, нейропротекторной и других видов активности.
Исследования одобрены локальным комитетом по этике при ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» МЗ РФ.
Степень достоверности материалов исследования Достоверность исследования определяется достаточным количеством данных, полученных с использованием 149 крыс, 2104 мышей, 20 лягушек и 38 кошек, 9 новых селенсодержащих металлокомплексных соединений и 3 препаратов сравнения (амтизол, мексидол, метапрот), соблюдением правил доказательной медицины (выборка, рандомизация, наличие контролей, препаратов сравнения), использованием адекватных методов исследования (нескольких моделей острой гипоксии, способов оценки систем кровообращения, внешнего дыхания, ЦНС, обмена веществ), корректной обработкой полученных данных с помощью современных компьютерных программ на сертифицированном оборудовании.
Апробация материалов исследования
Результаты и основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск,
2009), XXI съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Калуга,
2010), V Всероссийской конференции молодых учёных-медиков (Воронеж,
2011), VI Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция? (Москва, 2011), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), Всеросийской научной конференции с международным участием «Фармакологическая нейро-протекция», посвященной 90-летию Отделения фармакологии им. С. В. Аничкова (Санкт-Петербург, 2013), XXII съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию заслуженного деятеля науки РФ проф. Н. Н. Самойлова (Брянск, 2013), IV Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи-Дагомыс, 2014), проблемной комиссии Смоленской государственной медицинской академии «Физиология и патология нервной системы» (Смоленск, 2011, 2013), ежегодных итоговых заседаниях Смоленского отделения физиологического общества (Смоленск, 2008-2014).
Апробация диссертации состоялась на совместном заседании кафедр фармакологии с курсом фармации ФПК и ППС, патологической физиологии, нормальной физиологии, неврологии и нейрохирургии, общей и медицинской химии, биологической и биоорганической химии, фармацевтической химии и фармакогнозии, топографической анатомии и оперативной хирургии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» МЗ РФ, кафедры биологических дисциплин ФГБОУ «Смоленская государственная академия физической культуры, спорта и туризма».
По теме диссертации опубликованы 47 печатных работ, из них 16 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, 3 патента РФ на изобретения, 20 статей в сборниках научных работ, 8 тезистов.
Личный вклад автора Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в планировании экспериментов (90%), их непосредственном выполнении (95%), обработке полученных результатов (100%), обсуждении результатов, написании статей и тезисов (85%), написании диссертации и автореферата (90%).
Реализация результатов работы Полученные результаты нашли применение в учебном процессе на кафедре фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (акт внедрения от 20.05.2013 г.), в лекционных курсах кафедры фармакологии с курсом фармации ФПК и ППС (акт внедрения от 25.11.2014 г.) и кафедры нормальной физиологии Смоленской государственной медицинской академии МЗ РФ.
Диссертационная работа выполнена на кафедре нормальной физиологии Смоленской государственной медицинской академии МЗ РФ (заведующий — доктор медицинских наук профессор В.А. Правдивцев) в рамках плановой темы НИР, № гос. регистрации 01201167433 (протокол № 5 от 17.05.2011 г.), а также договора о совместной научно-практической деятельности между НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН и Смоленской государственной медицинской академией «Синтез и изучение фармакологической активности новых физиологически совместимых ангиоксидантов».
Структура и объём диссертации Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 4 главы собственных экспериментальных исследований, обсуждение результатов, выводы, научно-практические рекомендации и список литературы. Работа изложена на 312 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 48 рисунков. Библиографический указатель содержит 601 наименований, в том числе 353 отечественных и 248 иностранных.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследования Выбор животных. Согласно поставленной цели и конкретным задачам исследования эксперименты выполнены на 20 травяных лягушках, 2104 белых мышах-самцах линии CBF1 массой 20-25 г, 149 белых крысах-самцах линии Wistar массой 170 и 220 г и 38 беспородных кошках-самцах массой 3,5-4,5 кг.
В реализации работы руководствовались «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.).
Фармакологические средства для анализа. Поиск антигипоксических веществ проводили среди 9 новых металлокомплексных (2т\2+) химических соединений, содержащих селен в составе лиганда (табл. 1). Веществами сравнения служили широко известные антигипоксические средства - амтизол, мекси-дол и метапрот.
Исследованные селенсодержащиг металлокамплексные (Zn2*) соединения
Шифр вещества Лиганд, модифицированный селеном Дополнительный лиганд
3IQ1969 4-Гидроксикумарин нет
TtQ1970 3 - Ацетилкумарин нет
3101981 4-Гидрокси-З-ацетилкумарин нет
;iQ1983 3-Гидрокси-2-этил-5-меггилпиридин нет
3IQ1987 Ацетофенон 2-Меркаптобензим-имидазол
3IQ2078 2,6-Диметилбензохинон Дихлоруксусная кислота
jtQ2083 Диметилглиоксим нет
jtQ2170 Паральдегид Паральдегид
JIQ2252 Резацетофенон нет
Моделирование гипоксии. Состояние острой экзогенной гипоксии с ги-перкапнией (ОГ+Гк) на мышах и крысах моделировали, помещая животных в прозрачные гипоксические камеры объёмом в 0,25 и 1,0 л соответственно (Лукьянова Л.Д. и соавт., 1990).
Острую экзогенную гапобарическую гипоксию (ОГ+Гб) у мышей осуществляли путём «подъёма на высоту» (Лукьянова Л.Д. и соавт., 1990).
Состояние острой экзогенной гипоксии без гиперкапнии (ОГ-Гк) у крыс воспроизводили авторским способом (патент РФ №2291498,2007).
Состояние периодической (интервальной) дыхательной асфиксии у кошек обеспечивали путём циклического отключения/включения аппарата искусственной вентиляции лёгких (Виноградов В.М., Криворучко Б.И., 2001). Состояние острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией (ОГ+Гк) у кошек моделировали по способу A.B. Евсеева и М.А. Евсеевой (2005).
В ходе опытов с гипоксией у животных регистрировали электрическую активность мнокарда (крыса, кошка); параметры внешнего дыхания (крыса); определяли содержания 02 и С02 во вдыхаемом воздухе (крыса, кошка); оценивали с помощью метода вызванных потенциалов электрическую активность коры головного мозга (кошка) (Козлов С.Б., 1998; Евсеев A.B., 2008).
Также определяли у крыс величину стандартного энергетического обмена по модифицированному способу М.Н. Шатерникова (Васильева ЛЛ. и соавт, 1961); оценивали скорость потребления 02, измеряли ректальную температуру
(мышь, крыса, кошка); устанавливали средние летальные (LD») и средние эффективные (ED50) дозы для наиболее активных металлокомплексных соединений (мышь, крыса) устанавливали по методике В.Б. Прозоровского и соавт. (1978); изучали условнорефлекторную деятельность мышей, ориентируясь на показатели оборонительного условного рефлекса (Анохин П.К., 1968).
В опытах, выполненых на изолированном нефиксированном сердце лягушки (авторский способ) оценивали кардиотропные эффекты веществ по изменению показателей биоимпеданса и ЭКГ (патент РФ № 2479871,2013).
Изученные металлокомплексные вещества и вещества сравнения вводили животным внутрибрюшинно (в/б) и внутрь через зонд. При проведении скрининга на мышах - за 60 мин до начала опыта (период инкубации) в дозах 10,25, 50 и 100 мг/кг. В прочих исследованиях перспективные вещества вводили внутрь в наиболее эффективной по данным скрининга дозе. В этих опытах период инкубации для мышей и крыс составлял соответственно 60 и 90 мин, а для кошек — 180 мин. Животным контрольных групп вместо фармакологических агентов вводили равные объёмы физиологического раствора хлорида натрия.
Статистический анализ проводили с помощью методов вариационной статистики, используя пакеты прикладных программ Microsoft Excel 2007 и Statistica 7.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно полученным данным, продолжительность жизни мышей в условиях ОГ+Гк и резервное время в условиях ОГ+Гб в среднем составили 25,8 мин. и 5,16 мин. соответственно, что полностью согласуется с литературными данными (Лебедева С.А. 2003; Левченкова О.С., 2006; Евсеев A.B., 2008).
В ходе скрининга было установлено, что лишь 2 из 9 селенсодержащих металлокомплексных (Zn2+) соединений, а именно JtQ1983 и 7CQ2170, в широком диапазоне доз обеспечивали отчётливое защитное действие при выбраных способах введения (рис. 1).
Как оказалось, защитные эффекты обоих веществ закономерно сопровождались гипотермическим действием. Наиболее выраженный и дозозависимый акгигипоксический эффект был отмечен у соединения JtQ1983, с селенсодер-жащим лигандом 3-гидрокси-2-этил-5-метилпиридином. В частности, после введения внутрь в дозах 25, 50 и 100 мг/кг вещество nQ1983 увеличивало продолжительность жизни мышей в условиях ОГ+Гк в 2,2; 2,9 и 3,6 раза. Для вещества rcQ2170 с паральдегидом в качестве основного и дополнительного се-ленсодержащего лиганда при тех же условиях прирост показателя составил 1,5; 2,7 и 2,9 раза.
В ходе изучения свойств эталонных веществ (амтизол, мексидол, бемитил) было установлено, что при ОГ+Гк и ОГ+Гб лишь амтизол обеспечивал защитное действие после в/б введения и после введения внутрь (рис. 2). Однако его эффект заметно уступал действию веществ JtQ1983 и 7tQ2170.
ЕЮ 10 мэ/ка 23 мг/ка ЦЩ 50 мег/к& 100 м&Лее
Рис I Влияние наиболее активных селенсодержащих металлокомплексных (2п2+) соединений (^1983, я<32170) на продолжительность жизни мышеи в условиях острой гипоксии с гиперкапнией (А) и резервное время в условиях острой гипобарической гипоксии (Б) после в/б введения и введения внутрь
"вбЗЙИ "^Лга;сидоЛ МекСМЯРЛ АЛ1ТИ Жйт О О л Амтизол Метапрот леовтаэтрот
ШШ Контроль ППЗ Ю ма/ка ЦЦ 25 мг/ке н ЗО ме/ке ЮО М&/К&
Рис 2 Влияние веществ сравнения (мексидол, амтизол, метапрот) на продолжительность жизни мышей в условиях острой гипоксии с гиперкапнией (А) и резервное время в условиях острой гипобарической гипоксии (Б) после в/б введения и введения внутрь. * -р<0,05.
Динамика изменения температурных кривых на фоне действия проявивших себя металлокомплексных веществ позволила получить представление о продолжительность их действия, в том числе и после введения внутрь (рис. 3).
Суточная динамика изменения ректальной температуры у мышей после введения внутрь веществ яф983 (А) и я<32170 (Б)
Так, в зависимости от дозы биологическая активность jtQ1983 сохранялась в течение 5-12 ч. В свою очередь, после введения вещества TtQ2170 эффект отмечали на протяжении 5-8 ч. В этих же опытах было выявлено токсическое действие вещества jcQ217Q — после его введения внутрь в дозе 50 мг/кг наблюдали отдельные случаи гибели мышей, а доза 100 мг/кг приводила к тотальной гибели. Данный факт требовал в дальнейшем установления показателей острой токсичности для обоих металлокомплексных соединений.
Таким образом, на предварительном этапе исследования было установлено, что вещества 7tQ1983 и 7CQ2170 оказывают защитное действие в условиях ОГ+Гк и ОГ+Гб не только после в/б введения, но и после их введения внутрь. Важно подчеркнуть, что в доступной литературе отсутствуют какие-либо сведения о наличии у химических веществ отчётливого защитного действия при формировании острой гипоксии в случае их введения в организм через ЖКТ (Евсеев A.B. и соавт., 2006; Катунина Н.П., Катунин М.П., 2007; Новиков В.Е. и соавт., 2010; Harik S.L. et al„ 1995; Beaumont Т., 2002). В наших опытах энте-ральное введение металлокомплексных соединений обеспечило эффект вполне сопоставимый с результатами их в/б введения. При этом динамика измерения ректальной температуры показала, что вне зависимости от способа введения развитие эффекта ;tQ 1983 и <tQ2170 происходит почти с равной скоростью.
В ходе сравнения показателей острой токсичности, проведенного в отношении веществ ?tQ1983 и 7tQ2170, было установлено, что оба вещества являются опасными. Тем не менее, полученные данные о средних эффективных дозах позволили более позитивно взглянуть на вещество jiQ1983. В частности LD50 TCQ1983 после введения мышам в/б и внутрь составила соответственно 103,0 и 178,0 мг/кг при средних эффективных дозах (ED50) 29,5 и 28,2 мг/кг. Расчет терапевтического индекса при условии энтерапьного применения вещества составил 6,3, что подтверждает возможность его использования в качестве фармакологического средства. В дополнительной серии опытов по изучению токсично-
ста вещества яС>1983, выполненной на крысах, возможность его применения внутрь вновь была подтверждена (терапевтический индекс 5,1).
Для вещества лС>2170 после в/б применения и введения внутрь показатель иэ50 составил соответственно 56,2 и 70,8 мг/кг при ЕВ50 - 25,7 и 22,4 мг/кг. Расчёт его терапевтического индекса для энтерального введения составил 3,1 и исключал возможность изучения вещества в рамках исследования.
Таким образом, для углублённого изучения было отобрано вещество яф983 - гексакис (3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридинато) [трис(дибензил-диселенидо)] дицинк(П) пентадекасемигидрат. В качестве вещества сравнения было решено использовать антигипоксант амтизол - 3,5-диамино-1,2,4-тиадиазол. Доза для обоих соединений в последующем составляла 100 мг/кг, как наиболее эффективная из всех изученных при введении внутрь.
Так как в опытах с определением ЕО50 и ЕОзо вещества я(21983 было доказана его достаточная эффективность при введении внутрь, последующие эксперименты осуществляли, используя только этот путь введения.
В связи с тем, что после введения вещества л(31983 и антигипоксанта ам-тизола в течение периода инкубации отмечали ряд изменений в поведении мышей и крыс (снижение моторной и исследовательской активности, снижение или утрата таксиса на пищу и воду) были проведены опыты на мышах по изучению условнорефлекторной деятельности.
Как было установлено, ежедневное в течение 5-ти дней введение вещества лф983 мышам в дозе 100 мг/кг полностью блокировало выработку избегатель-ного оборонительного условного рефлекса. В свою очередь антигипоксант амтизол при равных условиях снижал выработку рефлекса на 41,7%. Показатели реакции активного избегания для обученных животных были следующими: латентный период — 5,8±0,7 с, время активного избегания - 25,4±3,6 с.
Изучение влияний вещества 71*31933 и амтизола на показатели условно-рефлекторной деятельности в группах мышей с предварительно выработанным условным рефлексом показали, что оба вещества оказывают негативное влияние на процесс его осуществления (рис. 4).
Изначально влияние металлокомплексного соединения обнаруживало себя в изменении времени активного избегания, которое через 30 мин после введения уменьшалось почти в 2 раза (-43,9%). Через 60 мин наблюдения констатировали дальнейшее угнетение общей моторики, 3-кратное увеличение латентного периода при одновременном сокращении времени активного избегания до 22,6%. Тем не менее, через 15-20 ч после введения вещества я(31983 способность к осуществлению условнорефлекторных актов у мышей восстанавливалась по всем показателям.
Амтизол на условнорефлекторную деятельность мышей оказывал, в целом, сходное с эффектом вещества яф983 действие, но результат был менее отчётлив и переставал обнаруживать себя спустя 7-10 ч после введения.
Таким образом, в ходе опытов по изучению влияния веществ на условно-рефлекторную деятельность вновь была продемонстрирована относительная
безопасность селенсодержащего металлокомплексного (Xп2+) соединения 1983, что проявилось после введения вещества внутрь в полном восстановлении аналитико-синтетической деятельности корковых отделов ЦНС у мышей в течение суток.