Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему: Влияние стимуляции суперовуляции на гемостаз при экстракорпоральном оплодотворении и переносе эмбрионов в полость матки
Автореферат диссертации по медицине на тему Влияние стимуляции суперовуляции на гемостаз при экстракорпоральном оплодотворении и переносе эмбрионов в полость матки
На правах рукописи
ИВАНЕЦ Татьяна Юрьевна
ВЛИЯНИЕ СТИМУЛЯЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ НА
ГЕМОСТАЗ ПРИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОМ ОПЛОДОТВОРЕНИИ И ПЕРЕНОСЕ ЭМБРИОНОВ В ПОЛОСТЬ МАТКИ
14,00.46 - Клиническая лабораторная диагностика
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Работа выполнена в ГУ Научном Центре акушерства, гинекологии и перинатологии Российской Академии медицинских наук.
Доктор биологических наук, профессор Н.Д. Фанченко. Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор О.П. Шевченко
Доктор медицинских наук, профессор Р.Т. Тогузов
Ведущая организация: Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова.
Защита состоится «_»_2004г. в_часов на заседании
диссертационного совета Д 208.071.04 при Российской медицинской академии последипломного образования по адресу: 123836, Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1.
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке РМАПО (Москва, ул. Беломорская, д. 19).
Автореферат разослан «_»_2004г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования
В последнее время все большее распространение в мире получает метод лечения абсолютного женского бесплодия путем экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в полость матки (ЭКО и ПЭ).
В процессе реализации программы ЭКО и ПЭ для стимуляции суперовуляции используются высокие дозы активных гормональных, препаратов [Смольникова В.Ю., Финогенова Е.А., 2000]. В ответ на действие этих препаратов в яичниках созревает большое количество фолликулов, продуцирующих половые гормоны, главным образом эстрадиол и прогестерон.
Одним из серьезных осложнений программы ЭКО и ПЭ является синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ), при котором уровень половых гормонов на порядок и более превышает таковой в спонтанном менструальном цикле [Schenker J.D., 1995]. СГЯ проявляется широким спектром клинических симптомов: от легких биохимических изменений до выраженного увеличения размера яичников, появления асцита и выпота в плевральную полость, гемоконцентрации, олигурии, а также гиперкоагуляции, вплоть до угрожающих жизни нарушений гемостаза (тромбоз магистральных и периферических сосудов).
Хорошо известно, что половые гормоны оказывают влияние на систему свертывания крови. Показано, что изменения в системе свертывания крови коррелируют с циклическими изменениями уровня этих гормонов в спонтанном менструальном цикле [Kadir R.A., 1999]. Имеются также многочисленные литературные данные, свидетельствующие о том, что прием комбинированных оральных контрацептивов (КОК) вызывает изменение различных гемостазиологических параметров и увеличивает риск развития венозных тромбозов [Jick Н.. 1995, Kluft С. 1997, Vasilakis С, 19991. И хотя риск
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА CfUrenüypr <?/М
тромботических осложнений при использовании оральных контрацептивов последнего поколения невелик, их применение является основной причиной тромботических заболеваний у молодых женщин [Rosendaal F.R., 1999].
Сведения о состоянии системы свертывания крови у пациенток в ходе реализации программы ЭКО и ПЭ в доступной нам литературе отсутствуют. Однако, учитывая чрезвычайно высокий уровень половых гормонов, наблюдаемый у таких пациенток, логично было предположить, что у них могут возникать заметные изменения параметров гемостаза и что эти изменения могут иметь диагностическую значимость.
Таким образом, представлялось актуальным получение и анализ данных о состоянии системы гемостаза у пациенток в процессе стимуляции суперовуляции. Цель исследования
Оценка влияния стимуляции суперовуляции на систему гемостаза при использовании различных схем стимуляции в процессе реализации программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в полость матки.
1. Исследовать параметры гемостаза и уровень половых гормонов в спонтанном менструальном цикле (5-7 день и 21-23 день) - контрольная группа 1.
2. Оценить параметры гемостаза и уровень половых гормонов на фоне приема оральных контрацептивов - контрольная группа 2.
3. Определить исходные параметры гемостаза и уровень половых гормонов у пациенток программы ЭКО и ПЭ до начала стимуляции.
4. Провести сравнительный анализ параметров гемостаза и уровня прогестерона и эстрадиола в ходе стимуляции суперовуляции с использованием различных гормональных препаратов (агонистов и антагонистов гонадолиберина).
-35. Оценить параметры гемостаза на момент первичной диагностики беременности (14-й день после переноса эмбрионов) в зависимости от эффективности программы ЭКО и ПЭ. 6. Определить диагностическую значимость лабораторных параметров гемостаза у пациенток на разных этапах реализации программы ЭКО и ПЭ.
Впервые в данной работе проведен сравнительный анализ лабораторных параметров системы гемостаза при использовании различных схем стимуляции суперовуляции и оценена их диагностическая значимость на разных этапах реализации программы ЭКО и ПЭ.
В результате проведенной работы разработан алгоритм исследования параметров системы гемостаза у пациенток в процессе стимуляции суперовуляции с целью профилактики развития синдрома гиперстимуляции яичников и повышения эффективности и безопасности программы ЭКО и ПЭ.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты проведенных исследований внедрены в практику работы отделения сохранения и восстановления репродуктивной функции и лаборатории клинической эмбриологии ГУ Научного Центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, а также других структур, занимающихся лечением абсолютного женского бесплодия.
Материалы диссертации доложены на XVII и XVIII Международных конгрессах по тромбозам и гемостазу (Париж, 2001г. и Бирмингем, 2003г.). Диссертация апробирована на совместной конференции лаборатории эндокринологии, отделения сохранения и восстановления репродуктивной функции и лаборатории клинической эмбриологии ГУ Научного Центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (26 февраля 2004г.).
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Объем и структура работы
Работа изложена на 126 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, клинико-лабораторной характеристики пациентов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 133 (42 отечественных и 91 зарубежных) источников литературы. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 7 рисунками.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. В процессе стимуляции суперовуляции у пациенток программы ЭКО и ПЭ фактор Виллебранда (ФВ) может являться неспецифическим маркером повреждения сосудистого эндотелия вследствие резкого повышения уровня половых гормонов в крови.
2. Стимуляция суперовуляции приводит к повышению коагуляционного потенциала крови за счет увеличения концентрации основного субстрата свертывания крови - фибриногена и повышения суммарной активности факторов, составляющих внешний и внутренний путь активации гемостаза.
3. Ранняя активация внутрисосудистого микротромбообразования (до момента переноса эмбрионов в полость матки) на фоне увеличения уровня ФВ является неблагоприятным прогностическим критерием и может влиять на эффективность циклов стимуляции.
Материалы и методы исследования
Отбор пациенток для исследования осуществляли на базе лаборатории клинической эмбриологии ГУ Научного Центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН из числа пациенток, обратившихся с жалобами на бесплодие.
В исследование были включены 70 женщин активного репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным фактором бесплодия. Длительность бесплодия составляла от 2-х до 6-ти лет.
Пациентки были разделены на три подгруппы, в зависимости от применяемой схемы стимуляции овуляции:
1. Стимуляция суперовуляции препаратом человеческого менопаузального гонадотропина (чМГ) с предварительной десенситизацией гипофиза ежедневным введением агониста гонадолиберина - подгруппа «Декапептил Дейли+чМГ» (40 пациенток).
2. Стимуляция суперовуляции препаратом чМГ с предварительной десенситизацией гипофиза однократным введением депонированной формы агониста гонадолиберина - подгруппа «Декапептил Депо+чМГ» (10 пациенток).
3. Стимуляция суперовуляции препаратом чМГ на фоне введения антагониста гонадолиберина - подгруппа «Оргалутран+чМГ» (20 пациенток).
В контрольную группу 1 вошли 25 здоровых женщин активного репродуктивного возраста с регулярным менструальным циклом.
В контрольную группу 2 вошли 20 здоровых женщин активного репродуктивного возраста, принимающих комбинированные оральные контрацептивы и наблюдающихся в отделении эндокринологии Центра. Длительность приема оральных контрацептивов составляла от 4 до 12 месяцев. Применяли КОК второго и третьего поколений.
Взятие крови у пациенток, включенных в исследование, проводили до начала стимуляции овуляции (21-23 день менструального цикла), на 5-7 день стимуляции, в день введения овуляторной дозы ХГ, в день переноса эмбрионов в полость матки и на 14-й день после переноса эмбрионов (первичная диагностика беременности).
В контрольной группе 1 обследование проводили на 5-7-й и 21-23-й дни цикла. Пациентки контрольной группы 2 были обследованы на 5-7 день менструального цикла.
Методы исследования гормонов
Определение концентрации эстрадиола (Е2), прогестерона (Р) и хорионического гонадотропина (ХГч) в сыворотке крови проводили иммуноферментным методом на автоматическом анализаторе «Cobas Core II» концерна «Hoffman La Roche» (Швейцария) с использованием коммерческих наборов этой же фирмы.
Методы исследования системы гемостаза
При выполнении данной работы определяли следующие параметры гемостаза:
1. Протромбиновое время (индекс) (ПВ).
2. Активированпое парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), в том числе и чувствительное к волчаночным антикоагулянтам (ВА).
3. Тромбиновое время (ТВ).
4. Концентрация фибриногена.
5. Активность антитромбина III(ATIII).
6. Активность протеина С.
7. Концентрация D-димера.
8. Концентрация фактора Виллебранда (ФВ).
9. Подтверждающий тест на ВА (в случае удлинения АПТВ, чувствительного к ВА).
Определенис проводили в цитратной плазме клоттинговыми и
хромогенными методами на автоматическом анализаторе «STA
Compact» (Diagnostica Stago, Франция) с использованием реагентов
производства этой же фирмы.
10. Определение количества тромбоцитов проводили на автоматическом гематологическом анализаторе «АВХ Micros 60 ОТ 16» фирмы «АВХ Diagnostics» (Франция).
Проведение контроля качества исследований
1. Внутрилабораторный контроль качества
Внутрилабораторный контроль качества осуществляли согласно Приказу №220 от 26 мая 2003 г. Министерства здравоохранения Российской Федерации об утверждении отраслевого стандарта "Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов" ОСТ 91500.13.0001-2003.
Ежедневный внутрилабораторный контроль качества проводили с использованием контрольных материалов производства фирмы «Hoffman La Roche» (Швейцария) - для гормональных исследований, «АВХ Diagnostics» (Франция) - для гематологических исследований, и фирмы «Diagnostica Stago» (Франция) - для коагулологических тестов.
2. Внешний контроль качества
Внешний контроль качества всех проводимых исследований осуществляли в рамках Федеральной системы внешней оценки контроля качества с использованием контрольных образцов, полученных в Центре внешнего контроля качества клинических лабораторных исследований.
Также проводили внешний контроль качества коагулологических исследований в рамках Международной программы внешней оценки контроля качества с использованием контрольных образцов, предоставляемых фирмой «Diagnostica Stago» (Франция).
Компьютерный анализ и статистическая обработка полученных результатов: Полученные результаты были статистически обработаны в программе Microsoft Excel 2000 с использованием прикладных программ итоговой описательной статистики и при помощи двухвыборочного t-теста для выборок с различными дисперсиями, исходя из модели нормального распределения данных. Статистически достоверными считались отличия при р<0,05. Данные представлены как среднее арифметическое + стандартная ошибка.
Результаты исследования и обсуждение
Первым этапом данной работы было исследование состояния системы гемостаза у здоровых женщин в зависимости от дня менструального цикла (контрольная группа 1, п=25) (Табл. 1).
Параметры гемостаза и уровень половых гормонов у здоровых женщин активного _репродуктивного возраста (контрольная группа 1)_
5-7 день цикла 21-23 день цикла
ПВ (%) 95,9±1,7 93,7±1,1
АПТВ (сек) 36,6t0,5 38,0±0,5*
Фибриноген (мг/дл) 293,8±б,7 298,4±6,6
ТВ (сек) 16,0±0,2 16,0±0,1
Б-димер (мкг/мл) 0,22±0,02 0,2610,01
Фактор Виллебранда (%) 107,0±2,7 93,5±1,4*
Тромбоциты (Ю'/мм-1) 250,б±7,7 253,1±6,4
ЛТШ (%) 104,4±1,8 10б,6±2,1
Протеин С (%) 104,0±2,8 108,5±2,2
Эстрадиол (пмоль/л) 273,4±46,2 518,1±61,3*
Прогестерон (нмоль/л) 1,9±0,3 34,5±7,5*
• - отличие от 5-7 дня цикла достоверно при р<0,05, а=0,05
Полученные результаты свидетельствуют о некотором снижении коагуляционного потенциала в лютеиновой фазе цикла, что представляется закономерным, с точки зрения физиологии. Как известно, в конце лютеиновой фазы наступает менструация, которая является следствием снижения уровня эстрадиола и прогестерона в крови, изменения, кровообращения в эндометрии, повышения внутрисосудистого фибринолиза и замедления процессов коагуляции крови в сосудах эндометрия. В свою очередь, прекращению кровянистых выделений в
начале цикла способствует усиление агрегации тромбоцитов в сосудах эндометрия [Жмакин К.Н., 1980].
Для оценки влияния половых гормонов на гемостаз следующим этапом работы было исследование системы свертывания крови у пациенток, принимающих комбинированные оральные контрацептивы (контрольная группа 2) (Табл. 2).
Параметры гемостаза и уровень половых гормонов на фоне приема ОК _(контрольная группа 2)_
Контрольная группа 1 (5-7 д.ц.) Контрольная группа 2 (5-7 д.ц.)
ПВ (%) 95,9±1,7 97,6±2,2
АПТВ (сек) 36,6±0,5 35,8±0,9
Фибриноген (мг/дл) 293,8±6,7 323,5±11,5*
ТВ (сек) 16,0±0,2 15,8±0,2
О-димер (мкг/мл) 0Д2±0,02 0,43±0,05* .
Фактор Виялебранда (%) 107,0±2,7 123,1±5,4*
Тромбоциты (К^/мм*) 250,6±7,7 27б,6±9,5*
АТШ (%) 104,4±1,8 101,8±2,1
Протеин С (%) 104,0±2,8 103,3±2,4
Эстрадиол (пмоль/л) 273,4±46Д 250,5±21,1
Прогестерон (нмоль/л) 1,9±0,3 2,0±0,4
* - различия между группами достоверны при р<0,05, а-Ю,05
Согласно исследованиям последних лет, прием КОК изменяет состояние системы гемостаза, при этом повышается активность систем как коагуляции, так и фибринолиза [Макацария А.Д., 2004]. Действительно, у пациенток контрольной группы 2 на фоне приема КОК в большинстве случаев отмечалось увеличение концентрации маркера тромбинемии - Б-димера (в 2 раза), рост показателей активации сосудисто-тромбоцитарного (количество тромбоцитов, ФВ) и прокоагулянтного (фибриноген) звеньев гемостаза по сравнению с контрольной группой 1.
Полученные результаты свидетельствуют о повышении тромботического потенциала у здоровых женщин на фоне приема гормональных контрацептивов, что подтверждает многочисленные литературные данные об активации системы гемостаза при возрастании уровня половых гормонов в крови, в том числе и при использовании КОК [Ясйепёаа! Б.Я., 2001]. Исключение составили такие параметры, как АТШ
и протеин С, изменение активности которых, вопреки мнению некоторых исследователей [Kitty W.M., 1998, Kluft С, 1997], в данной работе отмечено не было.
Достоверные изменения отдельных показателей свидетельствуют о существовании риска возникновения тромботических осложнений и подтверждают необходимость проведения гемостазиологического скрининга в течение всего периода приема КОК.
Необходимо отметить, что описанные изменения, которые являются признаком повышения тромботического потенциала крови, возникают даже на фоне применения препаратов с низким содержанием половых гормонов. При стимуляции суперовуляции в ходе реализации программы ЭКО и ПЭ происходит многократное увеличение уровня половых гормонов в крови [Смольникова В.Ю., Финогенова Е.А., 2000], что и заставило нас провести данное исследование.
Было обследовано 70 пациенток, включенных в программу, и проведён сравнительный анализ параметров гемостаза на фоне изменения уровня эстрадиола и прогестерона в ходе стимуляции.
До начала стимуляции у всех пациенток был оценен исходный уровень исследуемых параметров гемостаза и половых гормонов. Полученные данные не отличались от таковых в контрольной группе 1 в той же фазе цикла, что подтвердило возможность включения данных пациенток в программу ввиду отсутствия гемостазиологических противопоказаний для начала стимуляции суперовуляции.
Исходный уровень эстрадиола, свидетельствующий о функциональном состоянии яичников, во всех обследованных подгруппах пациенток был примерно одинаков. В дальнейшем в ходе стимуляции достоверное различие между подгруппами было выявлено на момент введения овуляторной дозы ХГ и на 14-й день после ПЭ: более высокий уровень Е2 имел место в подгруппе «Декапептил Дейли+чМГ» (Табл. 3). Следует
обратить внимание на тот факт, что у пациенток всех подгрупп в период после ПЭ была диагностирована в основном только легкая форма СГЯ.
Изменение уровня эстрадиола в крови (пмоль/л) в процессе реализации __ программы ЭКО и ПЭ _
Подгруппа До стимуляции (21-23 д.ц.) Стимуляция (5-7 день) День введения ХГ День ПЭ 14-й день после ПЭ
Декапептил Дейли+чМГ 562,4 ±43,5 6395,2 ±685,9 12355,7 ±1016,5 7374,1 ±1071,4 8683,3 ±1456,6
Декапептил Депо + чМГ 523,9 ±43,0 4942,8 ±1438,7 7976,6* ±695,0 8033,7 ±1105,2 3029,6* ±945.7
Оргалутраи + чМГ 476,4 ±31,2 6302,5 ±1084,5 9087Д* ±1035,2 7370,3 ±1492,8 3239,4* ±1642,1
* -отличие от подгруппы Декапептил Дейли+чМГ достоверно при р<0,05, о=0,05
Уровень прогестерона оценивали до стимуляции и после переноса эмбрионов (Табл. 4).
Изменение уровня прогестерона в крови (нмоль/л) в процессе реализации _ программы ЭКО и ПЭ_
Подгруппа До стимуляции (21-23 д.ц.) ДеньПЭ 14-й день после ПЭ
Декапептил Дейли+чМГ 30,5±7,3 234,2±36,1 305,1±59,6
Декапептил Депо + чМГ 25,7±4,2 194,5±41,2 93,б±15,0*"
Оргалутраи + чМГ 33,6±6,6 202,8±34,1 125,0±51,2*
* -отличие от подгруппы Декапептил Дейли+чМГ достоверно при р<0,05, о=0,05
Ко дню ПЭ концентрация прогестерона в крови возрастала во всех подгруппах и отличалась от такового до стимуляции в 6 - 7 раз. На 14-й день после ПЭ было выявлено достоверное различие между подгруппами по этому показателю, что связано с разной эффективностью исследуемых циклов стимуляции суперовуляции. Так, в подгруппе «Декапептил Дейли+чМГ» процент наступления беременности составил 37,5%, в подгруппе «Декапептил Депо+чМГ» - 10%, в подгруппе «Оргалутран+чМГ» - 20%. Соответственно уровень прогестерона в двух последних подгруппах к 14-му дню после ПЭ оказался существенно ниже.
Таким образом, в процессе стимуляции суперовуляции концентрация половых гормонов в крови возрастала настолько значительно, что это не могло не повлиять на систему гемостаза. Действительно, независимо от используемой схемы стимуляции было выявлено в той или иной степени однонаправленное изменение исследованных лабораторных параметров. С учетом существующего деления гемостатических реакций на клеточные и плазменные, данные целесообразно рассматривать с позиций изменений в отдельных звеньях системы гемостаза.
Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз в данной работе оценивали по двум показателям: количеству тромбоцитов и уровню фактора Виллебранда. Общее количество тромбоцитов не менялось на протяжении всей стимуляции, достоверно увеличиваясь лишь к 14-му дню после ПЭ (в подгруппе «Декапептил Дейли+чМГ» - на 22,3%, в подгруппе «Декапептил Депо + чМГ» - на 14,2%, в подгруппе «Оргалутран + чМГ» - на 23,7%) (Табл.5).
Изменепие количества тромбоцитов (103|MM3) В процессе реализации программы
До Стимуляция День ДеньПЭ 14-й день
Подгруппа стимуляции (5-7 день) введения после ПЭ
Декапептил 254,0 258,6 267,5 261,9 310,6*
Дейли+чМГ ±7,4 ±7,1 ±12,1 ±9,7 ±9,9
Декапептил 266,4 278,8 284,4 263,0 304,1*
Депо + чМГ ±11,6 ±17,7 ±10,1 ±15,1 ±8,5
Оргалутран • 246,9 274,4 262,8 280,1 305,5*
+ чМГ ±7,7 ±11,9 ±10,3 ±6,9 ±11,5
* - р<0,05, а=0,05 при сравнении с исходным уровнем (до стимуляции)
В то же время уровень фактора Виллебранда прогрессивно возрастал, начиная с первых дней стимуляции (Рис.1). Следует отметить, что динамика нарастания концентрации ФВ в исследуемых подгруппах различалась. Так, раньше, чем в других подгруппах (в 1,3 раза к 5-7 дню стимуляции по сравнению с исходным состоянием), возрастал уровень ФВ в подгруппе «Декапептил Депо+чМГ». С другой стороны, наибольшие
значения были отмечены в подгруппе «Оргалутран+чМГ», начиная с момента введения овуляторной дозы ХГ. При этом пик уровня ФВ в данной подгруппе, превосходящий исходное значение в 1,8 раза, был зарегистрирован на 14-й день после ПЭ, несмотря на то, что концентрация эстрадиола и процент наступления беременности были достоверно выше в подгруппе Декапептил Дейли+чМГ.
г? 120 -юо • 80 -60 ■
До Стимуляция День День ПЭ 14-й день стимуляции (5-7 день) введения ХГ после ПЭ
Для объяснения причины и механизма повышения уровня ФВ могут быть использованы следующие литературные данные. Во-первых, ФВ является важным компонентом адгезии тромбоцитов и специфическим маркером повреждения сосудистого эндотелия, клетки которого являются основным местом синтеза ФВ [Балуда В.П., 1980, Баркаган З.С., 1989]. Высокий уровень ФВ наблюдается при его интенсивном синтезе и высвобождении из эндотелиальных клеток вследствие длительного воздействия на них различных повреждающих факторов. Это подтверждается исследованиями других авторов, которые приводят
данные о повышении ФВ при различных заболеваниях, сопровождающихся повреждением сосудов - при атеросклерозе [Jansson J.H., 1991], геморрагическом васкулите [Баркаган З.С., 1989], при тяжелых формах гестозов [Алланазарова А.А., 1992] и многих других. При этом отмечалась прямая зависимость уровня ФВ от степени сосудистых повреждений [Mannucci P.M., 1998]. Во-вторых, хорошо известно, что половые гормоны оказывают влияние на сосудистый эндотелий [Stumpf W.E., 1976]. В-третьих, одним из основных этапов начала беременности является имплантация, связанная с прорастанием трофобласта в эндометрий, нарушениями целостности эндотелия и обнажения коллагеновых субэндотелиальных структур [Alpin J.D., 2000]. Поэтому, на наш взгляд, наиболее вероятным фактором, вызывающим значительный рост уровня ФВ является, с одной стороны, резкое увеличение в плазме крови концентрации эстрадиола и прогестерона на фоне стимуляции суперовуляции, а с другой - начало процесса имплантации в случае эффективных циклов ЭКО и ПЭ. При этом больший вклад принадлежит, по-видимому, воздействию высоких концентраций половых гормонов в крови, так как не было отмечено корреляции между частотой наступления беременности и уровнем ФВ. Повышенный синтез ФВ может приводить к патологической активации тромбоцитов, повышению их адгезии и агрегации, запуску внешнего и внутреннего механизмов свертывания и, как следствие, развитию диссеминированного сосудистого свертывания.
Таким образом, полученные данные могут свидетельствовать об усилении, прокоагулянтных свойств сосудистого эндотелия в ходе реализации программы ЭКО и ПЭ с последующей активацией тромбоцитов без начального изменения их абсолютного количества. Другими словами, ФВ может служить неспецифическим маркером повреждения сосудистого эндотелия на фоне резкого изменения уровня половых гормонов в крови при стимуляции суперовуляции.
Для оценки изменения прокоагулянтной активности плазмы крови на фоне стимуляции суперовуляции было проведено определение таких скринипговых параметров, как ПВ, ДШЬ, ТВ и концентрации фибриногена. Концентрация фибриногена непрерывно увеличивалась во всех подгруппах на фоне повышения уровня эстрадиола, начиная с 5-7-го дня стимуляции (Рис.2).
Рис 2. Изменение концентрации фибриногена в процессе реализации программы ЭКО и ПЭ
Ко дню ПЭ она превосходила исходный уровень в среднем в 1,4 раза. Однако на 14-й день после ПЭ в подгруппах с наименьшим процентом наступления беременности («Декапептил Депо+чМГ» и «Оргалутран+чМГ») концентрация фибриногена снижалась одновременно с уровнем эстрадиола и прогестерона, но при этом полученные значения были достоверно выше исходных.
Во всех подгруппах с 5-7-го дня стимуляции было отмечено достоверное укорочение тромбинового времени, которое характеризует конечный этап свертывания крови - превращение фибриногена в фибрин (Рис. 3).
Рис. 3. Изменение тромбинового времени в процессе реализации программ ЭКО и ПЭ
Увеличение протромбинового индекса и укорочение актавированного парциального тромбопластинового времени, свидетельствующие о повышении активности факторов как внешнего, так и внутреннего пути свертывания, происходило только к 14-му дню после ПЭ (Табл. 6,7).
Изменение ПВ (%) в процессе реализации программы ЭКО и ПЭ
Подгруппа До стимуляции (21-23 д.ц.) Стимуляция (5-7 день) День введения ХГ День ПЭ 14-й день после ПЭ
Декапептил Дейли+чМГ 92,3±1Д 92,3±1,3 91,3±1,1 95,6±1,7 97,3±1,3*
Декапептил Депо + чМГ 94,7±3,7 93,6±2,9 92,3±2,8 93,1±2,4 92,8±2,6
Оргалутран + чМГ 93,4±1,3 92,6±1,2 93,8±2,1 94,0±2,7 97,3±2,3*
• р<0,01, а=0,05 при сравнении с исходным уровнем (до стимуляции)
Только в подгруппе «Оргалутран+чМГ» укорочение АПТВ имело место уже к 5-7 дню стимуляции.
Изменение АПТВ (сек) в процессе реализации программы ЭКО и ПЭ
Подгруппа До стимуляции (21-23 д.ц.) Стимуляция (5-7 день) День введения ХГ День ПЭ 14-й день после ПЭ
Декапептил Дейли+чМГ 37,0±0,3 38,0±0,4 38Д±0,4 37,5±0,5 35,6±0,5*
Декапептил Депо + чМГ 38,0±0,8 37,6±0,7 36,6±0,5 36,3±и 32,8±1,9*
Оргалутран + чМГ 38,1±0,9 34,8±0,5* 34,7±0,6* 35,4±0,9* 33,1±1,1*
* - р<0,01, а=0,05 при сравнении с исходным уровнем (до стимуляции)
Эти результаты согласуются с данными, с одной стороны, о стимулирующем влиянии половых гормонов на синтез прокоагулянтных факторов свертывания клетками печени, приводящем к увеличению их концентрации в крови [Bloemencamp K.W.,1999, Olivieri О., 1995], а с другой стороны - об адаптационных изменениях в системе гемостаза при беременности, выражающихся в виде суммарного роста активности этих факторов [Макацария А.Д., 2002, Eldor А, 2001]. Однако, нужно отметить, что в доступной литературе мы не нашли работ по изучению системы гемостаза на очень ранних сроках физиологической беременности (1-2 недели). Можно предположить, что полученные изменения являются результатом как длительного воздействия высоких концентраций половых гормонов, так и наступлением беременности, поскольку были выявлены различия в подгруппах, отличающихся по эффективности циклов ЭКО и ПЭ.
Таким образом, в результате стимуляция суперовуляции приводит к повышению коагуляционного потенциала крови за счет увеличения концентрации основного субстрата свертывания - фибриногена и повышения суммарной активности факторов, составляющих внешний и внутренний путь активации гемостаза. При этом наблюдается зависимость выявленных изменений от эффективности программы ЭКО и ПЭ (наступления беременности).
Принципиально важно различать высокий потенциал свертывания крови (гиперкоагуляцию) и активацию гемостаза (внутрисосудистое
свертывание) в условиях тромбинемии различной степени [Макацария А.Д., 2002]. Повышение активности большинства прокоагулянтов в крови, включая фибриноген, может рассматриваться только как фактор риска расстройства микроциркуляции. Для выявления признаков возможной активации системы свертывания и фибринолиза в данной работе было использовано определение продукта деградации фибрина и одного из маркеров тромбинемии - D-димера (Рис. 4).
Рис. 4. Изменение концентрации D-днмера в процессе реализации программы ЭКО и ПЭ.
При оценке динамики концентрации D-димера в трех подгруппах были выявлены следующие закономерности. Уровень D-димера в подгруппе «Декапептил Дейли+чМГ» и подгруппе «Оргалутран+чМГ» значительно возрастал только ко дню переноса эмбрионов. Однако в подгруппе «Декапептил Депо+чМГ» на 5-7-й день стимуляции была отмечена достоверно более высокая концентрация D-димера, чем в других группах. Такая же тенденция была выявлена на момент введения овуляторной дозы ХГ, когда уровень D-димера в подгруппе «Декапептил Депо+чМГ»
превышал таковой в остальных группах в среднем в 1,5 раза. При этом самая высокая концентрация данного параметра на 14-й день после ПЭ, превосходящая исходную в 6,6 раза, была зарегистрирована в подгруппе «Декапептил Дейли+чМГ», что может объясняться высоким процентом наступления беременности в данной подгруппе (37,5%) и более высокой концентрацией Е2 и Р.
В доступной литературе нам не удалось найти данных об изменении уровня D-димера в процессе имплантации. Однако, многие авторы указывают на отсутствие в первом триместре беременности патологической активации гемостаза даже на фоне повышенной активности основных прокоагулянтных факторов [Макацария А.Д., 2003, Nolan Т.Е., 1993]. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наступление беременности в циклах ЭКО и ПЭ сопровождается активацией гемостаза на фоне высоких концентраций в крови половых гормонов, что усугубляется процессами, происходящими в эндометрии в ходе имплантации [Alpin J.D., 2000].
Необходимо отметить, что самая высокая концентрация D-димера на 5-7 день стимуляции и на момент введения овуляторной дозы ХГ, как и в случае с фактором Виллебранда, была зафиксирована в подгруппе «Декапептил Депо+чМГ», процент наступления беременности в которой был наименьшим. Поскольку D-димер, как известно, является маркером патологической активации гемостаза и внутрисосудистого микротромбообразования.[Макацария А.Д., 2002], можно предположить, что ранние изменения этого параметра в сочетании с одновременным ростом концентрации ФВ создают неблагоприятные условия для имплантации и могут снижать вероятность наступления беременности.
Таким образом,. ранняя активация внутрисосудистого микротромбообразования (до момента переноса эмбрионов в полость матки) на фоне увеличения уровня ФВ является неблагоприятным прогностическим критерием и может влиять на эффективность циклов
Повышенное или нормальное содержание прокоагулянтов следует рассматривать также и в сопоставлении с активностью их ингибиторов, выполняющих основную защитную функцию в отношении тромбообразования [Макацария А.Д., 2004]. В данной работе оценивалась активность АТШ и протеина С - основных естественных антикоагулянтов.
Согласно полученным данным, активность АТШ кратковременно снижалась по сравнению с исходным уровнем только на момент введения овуляторной дозы ХГ на пике концентрации Е2 в подгруппах «Декапептил Дейли+чМГ» и «Декапептил Депо+чМГ» (Табл. 8). В подгруппе «Оргалутран+чМГ» активность АТШ достоверно не изменялась на протяжении всего периода исследования.
Изменение активности антитромбина Ш в плазме крови (%)в процессе
Подгруппа. реали До стимуляции (21-23 д.ц.) зации программ Стимуляция (5-7 день) ы ЭКО и П День введения ХГ Э День ПЭ 14-й день после ПЭ
Декапептил Дейли+чМГ 103,4*1,8 102,0*1,3 96,6*1,4* 101,6±1,8 101,2*1,9
Декапептил Депо + чМГ 103,2*2,3 99,8*3,58 95,1±U* 96,7±3,9 102,0±3,9
Оргалутран + чМГ 98,9±2,2 102,5±1,9 100,5*2,2 101,7±2,3 103,3*2,8
* - р<0,05, п-0,05 при сравнении с исходным уровнем (до стимуляции)
Существует предположение, что снижение активности АТШ при нормально протекающей беременности или при использовании КОК не является причиной тромбоэмболических осложнений. По мнению некоторых авторов, снижение активности АТШ под действием эстрогенов является скорее результатом гемодилюции (вследствие задержки солей и воды в организме), чем результатом снижения синтеза или увеличения потребления АТШ [Идрисова Л.Э., 1995]. Другими словами, такое незначительное снижение активности АТШ может приводить к тромботическим осложнениям только в сочетании с другими изменениями в системе гемостаза. Кроме того, при определении клинического значения
снижения активности ATIII у пациенток в ходе реализации программы ЭКО и ПЭ необходимо оценивать уровень его активности до начала и в процессе стимуляции суперовуляции.
Противосвертывающие механизмы системы гемостаза могут быть также оценены с помощью определения активности протеина С, который обеспечивает естественную антикоагуляционную активность крови в условиях неспецифической активации гемостаза по типу спонтанных тромбозов [Ферстрате М., 1986]. В подгруппах «Декапептил Дейли+чМГ» и «Оргалутран+чМГ» было отмечен кратковременный подъем активности протеина С по сравнению с исходным состоянием (Табл. 9), что согласуется с литературными данными, свидетельствующими о возрастании активности протеина С под действием половых гормонов на фоне приема OK [Kitty W.M., 1998, Kluft С, 1997]. В подгруппе «Декапептил Депо+чМГ» активность протеина С, напротив, снижалась с 57 дня стимуляции, что наряду с увеличением уровня D-димера и ФВ, может свидетельствовать о высокой степени активации внутрисосудистого свертывания в данной подгруппе.
Изменение активности протеина С в плазме крови (%) в процессе реализации
Подгруппа До стимуляции (21-23 дц.) программы Э Стимуляция (5-7 день) СО и ПЭ День введения ХГ День ГО 14-й день после ПЭ
Декапептил Дейли+чМГ 100,3±2,6 108,9±2,7* 104,8±4,2 99,6±3,0 98,0±2,4
Декапептил Депо + чМГ 106,3*5,7 98,4±ЗД 91,6±1,8* 95,8±4,2 87,8±6,6**
Оргалутран + чМГ 99,7±4,2 111,6±3,0* 107,9±1,8 99,б±3,8 99,8±3,6
* - р<0,05, а=0,05 при сравнении с исходным уровнем (до стимуляции) *• - р<0,05, сН),05 при сравнении с другими подгруппами
Необходимо отметить, что на 14-й день после переноса эмбрионов у пациенток программы ЭКО и ПЭ проводится определение ХГч с целью первичной диагностики беременности. Как говорилось выше, одним из основных этапов начала беременности является имплантация, связанная с
прорастанием трофобласта в эндометрий и нарушением целостности эндотелия [Alpin J.D., 2000]. В связи с этим представлялось целесообразным сравнить исследуемые параметры гемостаза в эффективных и неэффективных циклах (Табл. 10).
Сравнительная характеристика параметров системы гемостаза в эффективных и неэффективных циклах стимуляции - суммарные данные (14-й день после переноса эмбрионов)
До стимуляции (п=70) Неэффективные циклы (п=51) Эффективные циклы (п=19)
ПВ (%) 93,0±0,9 94,9±1,2 100,6±1,9**
АПТВ (сек) 37,5±0,4 36,4±0,9 33,8±0,6**
ТВ (сек) 16,3±0,1 15,5±0,1* 14,4±0,2**
Фибриноген (мг/дл) 285,1±5,4 361,1±11,8* 455,2±25,8**
Ц-димер (мкг/мл) 0,26±0,01 0,92+0,11* 1,75±0,26**
Фактор Виллебранда (%) 89,3±2,7 134,3±6,2* 168,0±5,3**
Тромбоциты (103/мм3) 253,8±5,0 290,2±8,7* 342,5±18,5**
АТШ (%) 102,7±1,3 103,8±1,5 96,6±ЗД"
Протеин С (%) 101,0±2,1 99,6±2,2 93,9+3,8
Эстрадиол (пмоль/л) 538,1±27,б 2103,8+387,9* 10135,6±1773,1**
Прогестерон (нмоль/л) 28,8±5,1 92,1±13,6* 391,2±101,1**
Хорионический гонадотропил - 6Л±0,9 586,8±221,3**
* - при сравнении с исходным уровнем р<0,05, сН>,03
- при сравнении с неэффективными циклами р<0,01, а=0,05
Как видно из таблицы, беременность наступила у 19-ти пациенток (27,2%), при этом практически все параметры системы свертывания крови (кроме протеина С) и уровень половых гормонов у этих пациенток достоверно (р<0,01) отличались от таковых в группе пациенток с неэффективными циклами. Так, у пациенток, с наступившей беременностью уровень Е2 был выше в 4,8 раза, прогестерона - в 4,2 раза, концентрации фибриногена, Б-димера, ФВ - в 1,3, 1,9 и 1,3 раза соответственно, а активность АТ111 - на 7% ниже. Количество тромбоцитов у этих пациенток было на 18% выше, чем у пациенток с неэффективными циклами. Тем не менее, у пациенток с неэффективными циклами большинство исследуемых параметров оставались на более
высоком уровне, чем до стимуляции, т.е. несмотря на отсутствие беременности, сохранялось, по-видимому, воздействие высоких концентраций половых гормонов.
В данное исследование не вошли пациентки со средней и тяжелой степенью СГЯ, но с целью прогнозирования риска развития таких осложнений, а также более тяжелых нарушений в системе гемостаза, мы сочли целесообразным оценить пределы изменений вышеперечисленных параметров у обследованных пациенток, не имевших серьезных осложнений после проведения стимуляции. Результаты представлены в табл. 11.
Пределы колебаний гемостазиологических параметров у пациенток с легкой _степенью СГЯ в ходе реализации программы ЭКО и ПЭ_
День введения ХГ
14-й день после ПЭ
Берем, не наступила
ТВ (сек) О-димер (мкг/мл)
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что стимуляция суперовуляции в процессе реализации программы ЭКО и ПЭ сопровождается изменением основных лабораторных параметров, системы гемостаза независимо от используемой схемы стимуляции, причем эти изменения тем более выражены, чем больше возрастает уровень половых гормонов.
1. Стимуляция суперовуляции и последующий перенос эмбрионов в полость матки сопровождается усилением прокоагулянтных свойств сосудистого эндотелия, явлениями гиперкоагуляции и активации
внутрисосудистого свертывания крови; эти изменения возникают независимо от применяемой схемы стимуляции и даже в отсутствие осложнений (СГЯ).
2. Наиболее выраженные изменения (повышение) на фоне стимуляции суперовуляции претерпевают такие лабораторные параметры гемостаза, как уровень фактора Виллебранда, фибриногена, D-димера на фоне укорочения тромбинового времени.
3. Гиперреактивность системы гемостаза на протяжении стимуляции суперовуляции компенсируется сохранением в большинстве случаев на исходном уровне антитромбинового потенциала и активности протеина С.
4. Выявлена корреляция между ранним (до момента переноса эмбрионов в полость матки) увеличением концентрации D-димера и ФВ, снижением активности протеина С в крови и наступлением беременности в циклах ЭКО и ПЭ.
5. Выраженные изменения всех исследуемых параметров гемостаза у пациенток с наступившей беременностью в циклах ЭКО и ПЭ на 14-й день после переноса эмбрионов по сравнению с исходным фоном свидетельствуют о повышенном риске возникновения тромботических осложнений и ДВС-синдрома.
6. В циклах стимуляции суперовуляции, в которых беременность не наступила, сохраняются изменения большинства гемостазиологических параметров по сравнению с исходным состоянием, по крайней мере, до 14-го дня после переноса эмбрионов.
1. Проведение гемостазиологического скрининга до начала реализации программы ЭКО и ПЭ необходимо для оценки исходного состояния системы гемостаза и выявления возможных факторов риска.
Рекомендуемый набор тестов включает определение количества тромбоцитов, ПВ, АПТВ, в том числе и чувствительного к волчаночным антикоагулянтам, ТВ, активности АТШ, протеина С, концентрации фибриногена, D-димера, фактора Виллебранда. В случае необходимости проводится подтверждающий тест на ВЛ.
2. Для предупреждения развития осложнений у пациенток программы ЭКО и ПЭ требуется проведение гормонального мониторинга и гемостазиологических исследований во время проведения стимуляции суперовуляции (день введения овуляторной дозы ХГ, день ПЭ) и на 14-й день после переноса эмбрионов в полость матки. Рекомендуемый минимальный набор тестов включает определение концентрации фибриногена, D-димера, фактора Виллебранда, тромбинового времени, активности АТШ и протеина С.
3. В результате проведенной работы были получены пределы колебаний исследуемых лабораторных показателей системы гемостаза, позволяющих определить риск развития средней и тяжелой степени СГЯ (см. таблицу 11 в главе «Результаты исследования и обсуждение»).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Иванец Т.Ю., Иванец Н.В. D-димер - новый маркер для оценки состояния пациенток при реализации программы ЭКО и ПЭ.// Биомедприбор-2000: Материалы конференции. - Москва, 2000. - с. 284-285.
2. Иванец Т.Ю., Иванец Н.В. Оценка параметров системы свертывания крови у пациенток программы ЭКО и ПЭ в период после переноса эмбрионов// Мать и дитя: Материалы III Всероссийского форума. -Москва,2001.-с. 63-64.
-263. Иванец Т.Ю., Киндарова Л.Б., Иванец Н.В. Особенности параметров гемостаза при СГЯ у пациенток программы ЭКО и ПЭ.// Современные подходы к лечению бесплодия: Сб. научных трудов. -Екатеринбург, 2002. - с. 189.
4. Камилова Д.П., Корнеева И.Е., Назаренко Т.А., Иванец Т.Ю. Профилактика тромбоэмболических осложнений у пациенток с синдромом гиперстимуляции яичников. // Мать и дитя: Материалы III Всероссийского форума. - Москва, 2001. - с. 360..
5. Камилова Д.П., Фанченко Н.Д., Иванец Т.Ю. Использование фрагмина в профилактике тромбоэмболических осложнений у пациенток с синдромом гиперстимуляции яичников.// Акушерство и гинек. - 2002. - №2. - с.52-54.
6. Корнеева И.Е., Фанченко Н.Д., Леонов Б.В., Иванец Т.Ю., Камилова Д.П. Профилактика тромбоэмболических осложнений у пациенток с СГСЯ. //Проблемы репродукции. -2002. - № 1. - с. 30-33.
7. Фанченко Н.Д., Леонов Б.В., Щедрина Р.Н., Иванец Т.Ю., Яворовская К.А., Кузьмичев Л.Н., Киндарова Л. Б., Иванец Н.В. Оценка параметров гемостаза у пациенток программы ЭКО и ПЭ.// Проблемы репродукции. - 2000. - №5. - с. 34-38.