Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему: Изучение влияния γ-D-глутамил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность γ-лимфоцитов
Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение влияния γ-D-глутамил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность γ-лимфоцитов
На правах рукописи
ПЕТРОВ Александр Владимирович
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ у-Б-ГЛУТАМИЛ-Ь-ТРИПТОФАНА (БЕСТИМА) НА ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ
14.00 36-Аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук
Санкт - Петербург 2007
Работа выполнена в ФГУП Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов Федерального медико-биологического агентства России
Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор
Симбирцев Андрей Семенович
Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор
Назаров Петр Григорьевич
доктор медицинских наук, профессор Калинина Наталия Михайловна
Ведущая организация Государственный научный центр «Институт
иммунологии ФМБА России»
Защита диссертации состоится " 15 " октября 2007 года в /3 час на заседании Диссертационного совета Д 001 022 01 при Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу 197376, Санкт-Петербург, ул академика И П Павлова, д 12
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН
Автореферат разослан " 2007 года
Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук
Бурова Лариса Александровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В течение последних двух десятилетий, благодаря интенсивному развитию иммунологии, молекулярной биологии, биотехнологии и медицины, были достигнуты существенные успехи как в исследованиях развития иммунного ответа на различные виды антигенов, так и в изучении иммунопатогенеза заболеваний инфекционной и неинфекционной природы Это в значительной степени стимулировало интерес к иммуномодулирующим препаратам
В настоящее время значительно расширяется спектр иммунотропных лекарственных препаратов и показаний к их применению Наиболее активно развиваются в этом направлении препараты тимического происхождения Особое место среди них занимают синтетические препараты, такие как имунофан, тимоген и другие [Карсанова МИ и соавт, 1998, 2000, Лебедев В В и соавт, 1998, 1999, Нестерова И В и соавт, 2002, Старченко А А, 2002] В последние годы спектр этих препаратов пополнился новым синтетическим иммуномодулятором Бестим, который был синтезирован в ГосНИИ ОЧБ (г Санкт-Петербург) в середине 1990-х годов [Колобов А А и соавт , 1997]
Бестим (y-D-Glu-L-Trp) - дипептид, обладающий наибольшей активностью в ряду синтетических аналогов глутамил-триптофана Первый этап исследований его свойств выявил ряд перспективных преимуществ препарата При действии m vitro Бестим увеличивает продукцию ИЛ-2 лимфоцитами, усиливает их функциональную активность, активирует естественные киллеры В экспериментах на животных было показано, что дипептид также стимулирует Т-клеточное звено иммунитета, преимущественно активируя Т-хелперы 1-го типа, влияет на дифференцировку лимфоцитов, активирует макрофаги [Пигарева Н В , 2000] В то же время пути влияния Бестима на различные этапы дифференцировки Т-лимфоцитов остаются не до конца изученными
Опыт применения Бестима в клинике продемонстрировал перспективность данного препарата для лечения широкого круга заболеваний, сопровождающихся дисфункцией Т-клеточного звена иммунитета [Абрамова Н Н , 2005, Васильева Г Ю и соавт, 2002, Кукаркин НЮ, 2006, Лобзин ЮВ и соавт, 2001, Нестерова ИВ и соавт , 2002, Позняк А Л и соавт, 2000, Фаст М В , 2006]
Принимая во внимание это обстоятельство, актуальным является глубокое исследование иммуномодулирующих эффектов препарата, в частности, его влияния на дифференцировку и функциональную активность Т-лимфоцитов, в частности - на дихотомию Т-хелиеров в различных моделях иммуноопосредованной патологии
Протективная активность дипептида в модели туберкулезной инфекции была продемонстрирована ранее [Заболотных НВ , и соавт, 2001, Пигарева НВ , 2000], однако механизмы иммуномодулирующего действия, в частности, влияние на антиген-специфический иммунный ответ остаются не до конца ясными Кроме того, учитывая влияние Бестима на поляризацию Т-хелперов, представляется весьма актуальным изучение иммуномодулирующих свойств препарата в моделях аллергического иммунного ответа, в частности, при экспериментальной аллергической астме
Цель исследования. Изучение влияния Бестима на дифференцировку и функциональную активность Т-лимфоцитов Задачи исследования
1 Изучить влияние Бестима на различные этапы дифференцировки Т-лимфоцитов у мышей
2 Изучить иммуномодулирующую активность Бестима при различных путях введения у мышей
3 Исследовать иммуномодулирующее действие Бестима в модели экспериментальной туберкулезной инфекции
4 Исследовать иммуномодулирующее действие Бестима в модели аллергии
5 Исследовать влияние Бестима на количественные и функциональные показатели Т-клеток у больных хроническим вирусным гепатитом С
Научная новизна. В данной работе впервые с помощью многоцветной проточной цитофлюориметрии показано стимулирующее влияние Бестима на отдельные этапы дифференцировки Т-лимфоцитов
Впервые изучено влияние Бестима на антиген-специфический иммунный ответ в модели экспериментальной туберкулезной инфекции и выявлено его усиление с преимущественной активацией Т-хелперов 1-го типа
Впервые показана иммуномодулирующая активность Бестима в модели аллергической бронхиальной астмы и показано подавляющее действие препарата на системные и местные проявления патологического процесса
Впервые изучено иммуномодулирующее действие Бестима в комплексной терапии больных хроническим гепатитом С и установлено, что препарат стимулирует функциональную активность Т-лимфоцитов, преимущественно активируя Т-хелперы 1 типа
Практическая значимость. Продемонстрирована активность Бестима для стимуляции Т-хелперов первого типа, как в эксперименте, так и в клинике Показано, что при пероральном введении препарат сохраняет иммуномодулирующую активность, что существенно расширяет возможности его применения в амбулаторных условиях Выявлено достоверное противоаллергическое действие препарата Бестим, наряду с лечением иммунодефицитных состояний и некоторых инфекционных заболеваний, может быть применен для лечения аллергической патологии, в частности - бронхиальной астмы
Результаты диссертационной работы используются в работе НИИ фтизиопульмонологии при разработке схем комплексной терапии туберкулеза, а также в ГосНИИ ОЧБ для разработки новых схем лечения инфекционных и аллергических заболеваний
Основные положения, выносимые на защиту:
1 На основании проведенных исследований установлено, что Бестим ускоряет дифференцировку ранних предшественников Т-лимфоцитов в костном мозге, а также дифференцировку Т-клеток в тимусе
2 При пероральном введении Бестим в полном объеме проявляет иммуномодулирующую активность
3 Механизм протективного действия Бестима при экспериментальном туберкулезном процессе связан с активацией антиген-специфического иммунного ответа и поляризацией Т-хелперов в направлении Тх1
4 В модели аллергической бронхиальной астмы Бестим подавляет местные и системные проявления аллергического иммунного ответа
5 Иммуномодулирующее действие Бестима при хроническом гепатите С проявляется в поляризации иммунного ответа в направлении Т-хелперов 1-го типа
Личный вклад автора в проведение исследования Экспериментальные исследования, включающие приготовление необходимых препаратов, разработку схем их введения, работу с лабораторными животными, а также статистическая обработка и интерпретация полученных результатов выполнялись лично автором Роль остальных соавторов состояла в предоставлении ряда необходимых реактивов и препаратов, консультативной помощи при постановке иммунологических тестов, финансовой поддержке Моделирование экспериментальной туберкулезной инфекции и морфологический анализ проводились совместно с сотрудниками ФГУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Клиническое исследование эффективности и безопасности совместного применения Бестима и Пегинтрона® у больных хроническим гепатитом С проводилось на базе кафедры инфекционных болезней Российской военно-медицинской академии им С М Кирова Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VIII и X Всероссийском научном Форуме с международным участием имени акад В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2004, 2006), Международном конгрессе «Иммунитет и болезни от теории к терапии» (Москва, 2005), 6th FOCIS Annual Meeting (San Francisco, 2006), 29th European Peptide Symposium (Gdansk, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н Н Кеворкова «Иммунитет и аллергия от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006)
Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН 14 мая 2007 г
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 1 статья, 1 глава в монографии и 6 тезисов
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 152 страницах текста, включающего 40 таблиц и 6 рисунков Список цитируемой
литературы содержит 205 источников, в том числе 44 отечественных и 161 иностранных
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные животные и введение препарата. В работе использовались мыши линий C57BL/6 и FI (CBAxC57BL/6) (Питомник лабораторных животных «Рапполово»), а также беспатогенные мыши линии BALB/c и аутбредные мыши Swiss Webster (Питомник лабораторных животных «Пущино») Ампулированный препарат Бестим (ООО «НПФ Верта», любезно предоставлен к х н Колобовым А А ) разводили в стерильном физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно (в/б) в различных дозах в объеме 200 мкл Для перорального (п/о) введения препарата разводили в дистиллированной воде и вводили через пищеводный зонд в объеме 200 мкл Введения проводили ежедневно в течение 3 дней
Анализ иммунологических показателей. Через 24 или 72 часа после последнего введения клетки красного костного мозга, тимуса и селезенки выделяли асептически Экспрессию маркеров CD90 1 (Thyl) и CD117 (c-kit) на клетках костного мозга, CD4 и CD8 на тимоцитах и CD3, CD4 и CD8 на клетках селезенки анализировали с использованием соответствующих фшооресцеин- или фикоэритрин-меченых моноклональных антител (Caltag) помощью проточной цитофлюориметрии на цитофлюориметре EPICS XL (Beckman Coulter) Конканавалин А (КонА)-индуцированную пролиферацию спленоцитов и тимоцитов определяли про включению 3Н-меченого тимидина и выражали в импульсах в минуту (имп/мин) Также определяли КонА-индуцированную продукцию цитокинов, для чего тимоциты или спленоциты стимулировали различными дозами КонА и через 24 часа собирали супернатанты Активность Интерлейкина (ИЛ)-2 в супернатантах определяли с помощью ИЛ-2-зависимой линии CTLL-2 Концентрации ИЛ-2, ИЛ-4 и интерферона (ИФН)-у измеряли с помощью соответствующих иммуноферментных тест-систем (Pharmmgen) Автор выражает искреннюю благодарность кмн Пигаревой H В и к б н Котову А Ю за помощь в постановке иммунологических реакций
Экспериментальный туберкулез вызывали в/в инокуляцией культуры M tuberculosis Erdman (1х107 микробных тел/мышь) Начиная с седьмого дня после
заражения, каждые два дня проводились пробные вскрытия мышей с визуальной оценкой легких с целью выявления фокусов специфического воспаления Лечение было начинали при регистрации в легких множественных субмилиарных (<0,1 мм) очагов Мышей лечили противотуберкулезными препаратами (изониазид 10 мг/кг + рифампицин 10 мг/кг), и дополнительно Бестимом в течение 5 дней Бестим вводили в/б (0,1 или 1,0 мкг/кг) или п/о (0 1, 1 или 10 мкг/кг) Результа1ы регистрировали на 5, 12, 19 и 33 день от начала лечения Сравнение проводили с зараженными нелеченными животными (контроль заражения) и с группой контроля лечения, не получавшей Бестим Клинический эффект препарата оценивали по показателям тяжести течения экспериментального туберкулезного процесса коэффициентам массы легких и селезенки, индексу поражения легких, гистологической оценке легких и высеваемости МВТ из легких Также оценивали иммунологические показатели субпопуляционный состав тимуса и селезенки, КонА-индуцированную пролиферацию и продукцию цитокинов спленоцитами, а также, используя в качестве стимулятора вакцинный штамм М bovis BCG (BCG), антиген-специфическую пролиферацию и продукцию цитокинов Помимо ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-у также измеряли ИЛ-10 и ИЛ-12 с помощью коммерческих тест-систем (Pharmingen)
Экспериментальную аллергическую астму моделировали по Kato Y et al, 1999, с небольшими изменениями Беспатогенных мышей линии BALB/c иммунизировали овальбумином (OvA) (8 мкг/мышь) дважды с интервалом в 5 дней Бестим вводили в/б в дозе 0, 0 1 или 1 0 мкг/кг с 6 по 11 дни после первой иммунизации Далее, на 12, 16 и 20 дни после первой иммунизации проводили аэрозольное бустирование овальбумином и через 24 часа после последней аэрозольной экспозиции оценивали тяжесть течения экспериментальной аллер! ической астмы Исследовали клеточность и цитологический состав бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), титры анти-OvA IgE в сыворотке и БАЛ, выполняли гистологическое исследование ткани легких с окраской гематоксилин-эозином и Шифф-йодной кислотой с морфометрией Автор выражает искреннюю признательность Иольевой М Е за помощь при проведении морфологических исследований
Анализ влияния Бестима на показатели Т-клеточного иммунного ответа у больных хроническим гепатитом С (ХГС) проводился на клиническом материале
от больных, участвовавших в пилотном исследовании эффективности и безопасности совместного применения Бестима и Пегинтрона у больных ХГС 35 больных, инфицированных вирусом гепатита С 1-го генотипа в течение 48 недель получали терапию, состоявшую из пегилированного итерферона-а (Пегинтрон) и Бестима Периферическая кровь анализировалась до начала терапии и через 2, 12, 24 и 48 недель Цитофлюориметрически оценивали экспрессию маркеров CD3, CD4, CD8, CD25 на мононуклеарах периферической крови, а также изучали фитогемагглютинин (ФГА)-индуцированную продукцию ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-у и липополисахарид (ЛПС)-индуцированную продукцию ИЛ-10 в цельной крови с помощью иммуноферментного анализа (тест-системы производства ООО «Цитокин», г Санкт-Петербург)
Статистическая обработка результатов выполнялась стандартными методами с помощью t критерия Стьюдента, критериев Вилкоксона и Манна-Уитни, критерия %2, точного критерия Фишера, показателя корреляции г Обработка данных проводилась в программах «Microsoft Excel» и SPSS v 13 0
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние Бестима на дифференцировку Т-лимфоцитов у интактных мышей
Ранее с помощью лимфоцитотоксического теста было показано увеличение процента клеток, экспрессирующих Т-клеточный маркер Thyl, в красном костном мозге мышей после введения Бестима [Пигарева H В , 2000] В настоящей работе эти эксперименты были воспроизведены, но экспрессия маркеров оценивалась с помощью проточной цитофлюориметрии, которая является более современным и достоверным методом Результаты подтвердили сделанные ранее наблюдения (рис 1, В)
Учитывая полученные данные об увеличении процента клеток, экспрессирующих Thyl, в костном мозге, что свидетельствует о стимуляции созревания предшественников Т-лимфоцитов, была также изучена экспрессия маркера стволовых гемопоэтических и плюрипотентных клеток c-kit (CD117) В экспериментах на SPF животных было выявлено небольшое, но статистически достоверное увеличение количества клеток, экспрессирующих этот маркер на клетках костного мозга через 24 часа после однократного и трехкратного введения Бестима